・专题综述・ 北方园艺２０１３（１２）：１８８～１９１ 植物ＤＮＡ甲基化研究方法及进展 陈 曦，王 锐，丁国华 （哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江省高等院校植物学重点实验室，黑龙江哈尔滨１５Ｏ０２５） 摘要：该文在详细介绍ＤＮＡ甲基化机制、原理与研究方法的基础上，概述了国内外有关 ＤＮＡ甲基化研究的热点，分析了盐胁迫、氮处理、重金属处理、热胁迫、干旱胁迫等不同胁迫条件 下同种植物间基因的差异性表达和ＲＮＡ介导的ＤＮＡ甲基化和ＤＮＡ去甲基化等；阐述了多种 检测植物ＤＮＡ甲基化水平的技术，尤其对ＭＳＡＰ技术的基本原理、基本程序和应用实例进行了 较为细致的介绍；并对未来植物ＤＮＡ甲基化研究进行了展望。 关键词：ＤＮＡ；甲基化；进展；方法；ＭＳＡＰ 中图分类号：Ｑ ９４３ 文献标识码：Ａ文章编号：１００１－－０００９（２０１３）１２一Ｏ１８８—０４ 当前，有关植物ＤＮＡ甲基化的研究不断发展延伸， 后修饰等各个环节，从而保证了生命的周而复始。 ＤＮＡ甲基化可以称作是细胞记忆的一种机制，是 逐渐形成了较成熟的研究体系，虽然此类研究在许多植 物种类中尚属空白，却已经为某些关键问题的解答提供 了重要参考。ＤＮＡ甲基化是最早发现的基因表观修饰 的方式之一，可能存在于所有高等生物中。ＤＮＡ甲基 化调控了基因的表达［１］，ＤＮＡ甲基化能关闭某些基因的 活性，而去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。基 表观遗传学研究的“主角”，其中５’胞嘧啶甲基化是真核 生物ＤＮＡ甲基化的主要形式［１］。ＤＮＡ的甲基化是在 ＤＮＡ甲基化转移酶（ＤＮＭＴｓ）的作用下使ＣｐＧ二核苷 酸５’端的胞嘧啶转变为５’甲基胞嘧啶［２＿ ，这种ＤＮＡ修 饰方式并没有改变基因序列，由于甲基化ＤＮＡ不容易 被转录，因此ＤＮＡ甲基化被认为在发育的时序上限制 获得可转录基因。ＤＮＡ甲基化是基因组ＤＮＡ在转录 水平上进行调控的一种自然修饰方式，在高等植物中广 泛存在。其中胞嘧啶Ｃ５位的甲基化最为常见即５一甲基 因高度甲基化往往是非活化状态的标志，这些甲基化可 在诱导下发生去甲基化，从而使之具有转录活性。ＤＮＡ 甲基化属于表观遗传学范畴，在各种真核细胞表达调控 中有着重要的意义。 １植物ＤＮＡ甲基化概述 １．１ ＤＮＡ甲基化 胞嘧啶（５ Ｃ），而这些甲基化的胞嘧啶多集中于ＣｐＧ岛 上。ＤＮＡ甲基化是一种重要的遗传外修饰，是表观遗 传的重要组成部分，它参与了基因表达、生长发育、逆境 胁迫应答等过程睁 ］。随着对甲基化研究的不断深人， 各种甲基化研究的新思路、新方法应运而生以满足不同 类型研究的需求。 １．２植物ＤＮＡ甲基化研究进展 在经典遗传学中，基因序列的改变会引起生物体表 现型的改变，可以由亲代传给子代，然而现代分子生物 学则认为细胞中生物信息的表达是受２种因素控制的， １种是遗传调控（ｇｅｎｃｔｉｃ）；另１种是表观遗传调控 （ｅｐｉｇｅｎｃｔｉｃ）。遗传调控提供了“生产”维持生命活动所 必须的蛋白质“蓝本”；而表观遗传调控则指细胞怎样、 何时何地表达这些遗传信息。这２个因素的调控构成 一１．２．１ 国内研究热点随着研究的不断深入，人们对甲 基化的研究从开始的研究其机理、单种植物的甲基化状 况到后来试图去改变甲基化，以寻求更深入的研究表观 个网络，控制基因的转录、转录后加工、翻译以及翻译 遗传学对生物的作用机理和影响程度 ］。许多研究都 第一作者简介：陈曦（１９８７一），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研 究方向为植物学分子生物学。Ｅ－ｍａｉ１：ｗａｔｅｒｄｒｉｎｋｍｅ＠１６３．ｃｏｒｎ． 责任作者：丁国华（１９６３￣），男，山东梁山人，教授，研究方向为植物 分子生物学。Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｓｄｄｄｇｈ＠ｈｒｂｎｕ．ｅｄｕ．ｃａ． 在直接或间接的说明植物ＤＮＡ甲基化对基因表达调控 过程的重要意义，研究较多的有盐胁迫、氮处理、重金属 处理及干旱胁迫、热胁迫等。提升植物基因组的甲基化 水平可以达到抗盐胁迫的效果，推断这可能是植物抗盐 基金项目：国家自然科学基金重点资助项目（３０８３００２７）；黑龙江省 高校科技创新团队研究计划资助项目（ＫＪＴＤ－２０１１—２）；哈尔滨师 范大学科技发展预研计划资助项目。 收稿日期：２０１３－－０１－－０４ １８８ 性机理之一。另外，不同品种间的耐盐性也存在差异， 这些差异也与甲基化水平相关。另外，在水亏缺盐分高 的豇豆根尖基因组中检测到有超甲基化的情况；盐胁迫 北方园艺２０１３（１２）：１８８～１９１ 下的玉米幼苗甲基转移酶表达量减少，基因组甲基化程 度降低；盐胁迫造成油菜特异位点的低甲基化，用浓度 为１０￣２００ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＮａＣ１胁迫油菜植株，结果不同甲 基化类型消失、出现或发生转换，包括甲基化从头合成 与去甲基化［９］。氮处理可使ＤＮＡ甲基化发生变异。运 用ＭＳＡＰ技术对水稻进行研究，显示在低氮及无氮水平 下，处理样本的ＤＮＡ甲基化水平较大幅度的降低，其 中，以ＣＮＧ甲基化水平的降低为主，进一步对其进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交，结果发现多个结构基因及转座子基因的 探针都发生了改变，从而验证了ＣＮＧ位点的去甲基化 现象［１ 。重金属处理在致死浓度范围以内影响甲基化 的状况。将拟南芥种子置于不同浓度的氯化镉培养基 中，并设计无处理对照，２周后移苗解除胁迫，发现低浓 度Ｃｄａ 可以促进拟南芥种子的萌发，浓度在０．５ ｍｇ／Ｌ 时萌发率最高。分别提取叶幼苗期和抽薹期基因组 ＤＮＡ，采用ＭＳＡＰ技术分析其甲基化情况，结果显示随 着ＣｄＣ１ 浓度的增加，其ＤＮＡ甲基化程度也随之增 高［１ 。热胁迫影响植物的生长、发育及种子寿命。以油 菜耐热品种和不耐热品种的种子为试材，检测不同温度 下种子的活力及基因组ＤＮＡ的甲基化水平，通过 Ｍ 方法检测，热胁迫后的种子基因组ＤＮＡ甲基化 水平降低，同时发生了甲基化和去甲基化现象，也就是 说，在热胁迫过程中，种子可能通过ＤＮＡ甲基化的变化 来调控相关基因表达以应对高温胁迫Ｌ１ 。干旱胁迫会 使ＤＮＡ甲基化会表现出一定时空特异性和品种特异 性。研究水稻抗旱和旱敏感样本苗期和分蘖期ＤＮＡ甲 基化的变化，再分别比较叶片和根部ＤＮＡ甲基化的变 化情况，结果显示水分胁迫导致ＤＮＡ甲基化平均水平 显著升高，其中根部甲基化增加幅度相对明显，另外， ＤＮＡ甲基化水平及状态变化在品种间存在差异，因此 干旱胁迫反应过程中，试验结果可能还与品种抗旱性 相关 。 １．２．２国外研究的新方向 １９４２年，ＷａｄｄｉｎｇｔｏｎＥ¨］就 首次提出了ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ一词，并指出表观遗传与遗传是 相对的，从此揭开了表观遗传学研究的新篇章，其中 ＤＮＡ甲基化作为表观遗传修饰的重要形式又随之被冠 以浓墨重彩的一笔。ＲＮＡ介导的ＤＮＡ甲基化是基因 组表观遗传修饰的重要形式，它最初是在类病毒侵染的 转基因植物中发现的，在拟南芥中研究的最为深入，在 所有位点的重新甲基化、ＣＧ和ＣＨＧ位点的维持甲基化 以及ＣＨＨ位点的去甲基化中都有涉及。Ｈａｂｕ等［１。 发 现植物中ＭＯＭ１可以不依赖ＤＮＡ甲基化的引起转录 后的基因沉默；此外，拟南芥突变体中检测出ＲＮＡ的积 累以及不同位点不同程度的低甲基化ｎ引。病原菌胁迫 ・专题综述・ 可导致抗性基因出现低甲基化，此外，在全基因组范围 内还会出现超甲基化现象［】 Ｉ１８］，Ｐｅｎｇ等［１叼认为这有利 于植物逆境适应与进化。ＴＭＶ感染烟草后，病原菌响 应基因在过敏性反应出现后１２ ｈ表达量迅速上升，２４ ｈ 后，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测表明甲基化已明显下降。病原菌 感染后，可增强对相同或类似胁迫的抗性［２ ，揭示抗性 基因甲基化、表达与同源重组变化可能传递或部分传递 给后代。近年来涌现出１０余种ＤＮＡ甲基化的检测技 术，除了上述所介绍的基于分子生物学的研究外，同时 借助于化学的甲基化研究方法正在悄然兴起Ｌ２ ，大致可 以分为２类：特异位点的甲基化检测和全基因组的甲基 化分析。近年来，科学家们在ＤＮＡ定点检测、结构分析 和药物设计方面做了大量工作 ，有机化学和解析方 法都可以用于甲基化检测。例如，荧光阳离子共轭聚 合物（ＣＣＰ）建立了甲基化检测，２００８年，ＣＣＰ１（Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅｓ）与单核苷酸以延长为基础用 来检测甲基化所发生的特定位点，如Ｐ１６。这个方法包 含重亚硫酸盐处理和ＰＣＲ扩增［２ａ－２４］。此外还有胞嘧啶 甲基化钒氧化［２引、胞嘧啶甲基化锇氧化Ｉｚ 和１、４－２甲 基萘醌氧化单个光电子等＿２ 。其它分析方法对甲基化 检测也有重要意义，并逐渐被认识和应用。其中，高效液 相色谱法可以对全基因组ＤＮＡ进行甲基化检测［３０－３ ，可 作甲基化图谱分析，此法是目前测定基因组ＤＮＡ中５ｍＣ 总量最标准的方法；基因芯片技术可用于甲基化检测ｌ３ ， 且芯片种类不一，基因芯片是近十几年来发展极快的一项 技术平台，具有高通量、高灵敏度、快速自动等显著的特 点［３ ，ＣｐＧ岛甲基化检测芯片也有所发展，但速度缓慢。 目前国际上仅几个研究小组在开展ＤＮＡ甲基化芯片的 研究工作。各种芯片技术以不同的ＤＮＡ预处理方法为 基础，包括限制性内切酶和免疫沉淀等［３ 。 ２植物ＤＮＡ甲基化检测和研究方法 ２．１ 甲基化的主要检测方法 ＤＮＡ胞嘧啶甲基化分析可以针对特定序列，也可 以针对全基因组，根据检测的目的可以选择不同的分析 方法。将这些方法进行总结，大致可分为３类：第１类以 ＨＰＬＣ技术为基础，主要检测全基因组甲基化水平［３ ； 第２类以测序为基础，主要检测特定序列胞嘧啶甲基化 位点ｌ［３ ；第３类以ＰＣＲ技术为基础，既可以分析全基因 组甲基化水平，也能分析特异序列的甲基化位点［３ 。 ２．２ 主要研究方法举例——ＭＳＡＰ ２．２．１ ＭＳＡＰ基本原理 ＭＳＡＰ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＤＮＡ甲基化敏感扩增多态性） 是一种敏感性好、实用性强的检测ＤＮＡ甲基化的技术。 该方法是在ＡＦＬＰ技术的基础上发展而来的，利用对 １８９ ・专题综述・ ＤＮＡ甲基化敏感性不同的同裂酶（Ｈｐａ ＩＩ和Ｍｓｐ Ｉ）分 别切割ＤＮＡ，它们都能识别并切割５，＿ＣＣＧＧ序列，但 该过程受识别序列中胞嘧啶的甲基化程度影响。Ｈｐａ ＩＩ对甲基化敏感，当识别序列中有１个或２个嘧啶碱基 被甲基化时则不能切割（２条链都甲基化），Ｍｓｐ工对甲基 化不敏感，能切割内甲基化的Ｃ５ ＣＧＧ，但不能切割５ ＣＣＧＧ。用ＥｃｏＲ Ｉ／ＨｐａⅡ和ＥｃｏＲ Ｉ／Ｍｓｐ工分别对基因组 ＤＮＡ限制消化，将产生的不同酶切产物添加接头，进行 ＰＣＲ扩增、ＰＡＧＥ电泳、银染，产生可见的具有不同酶切 型式的谱带，即可得知ＤＮＡ甲基化信息。 ２．２．２ ＭｓＡＰ的基本程序 提取高质量基因组ＤＮＡ 酶切连接后进行预扩增，将预扩增产物稀释４Ｏ倍后，作 为选择性扩增的模版备用；基于不同的选择性扩增引物 组合进行选择性扩增，根据不同的变量进行标记；产物 变性后在６ 的序列胶上跑电泳，即进行变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳；将胶板进行银染，统计并分析ＤＮＡ条 带［３ 。ＭＳＡＰ方法所检测的“ＣＣＧＧ”位点甲基化结果有 ４种类型，第联型：Ｈａｐ［［和ＭｓｐＩ￣有带；第Ⅱ类型：Ｈａｐ］］ 有带，ＭｓｐＩ无带；第１ＩＩ类型：Ｈａｐ］Ｉ无带，ＭｓｐＩ￣带，第Ⅳ类 型：ＨａｐｌＩ和ＭｓｐＩ都无带（表１）。 表１ ＭＳＡＰ方法检测的甲基化结果 Ｔａｂｌｅ １ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｔｃｅｔｅｄ ｂｙ ＭＳＡＰ 注：Ｈａｐｌｌ和Ｍ￣ｐＩＰ．能准确识别ｌ、Ⅱ和ＨＩ类型的情况，因此统计的“ｃｃｃ，Ｇ，￣基因 组水平甲基化程度可能比实际低。 ３ ＭＳＡＰ方法应用实例 ＭＳＡＰ法近年来被广泛用于水稻 。 、棉花［ 、苹 果 和拟南芥 等基因组的胞嘧啶甲基化检测，其它 研究中也用于对香蕉 ］、油棕 、马铃薯 等ＤＮＡ甲 基化状况的了解。另外，付胜杰等［４８］利用ＭＳＡＰ技术 分析了小麦的甲基化水平，结果表明，叶锈菌虽没有诱 导稳定且特异的植物基因组ＤＮＡ胞嘧啶位点的甲基化 模式发生改变，但子代及其感病亲本之间存在着表观遗 传学差异。王春国等 叼研究表明，不同倍性西瓜中， ＤＮＡ甲基化均有发生，但不论是从总甲基化率还是全 甲基化率看，ＤＮＡ甲基化水平与倍性高低关系并不大， 三倍体西瓜表现出较为显著的低甲基化水平特征等。 ４展望 近１０ ａ来，植物ＤＮＡ甲基化的机制、原理与研究方 法等逐渐被人们所认知，其中ＲＮＡ介导的ＤＮＡ甲基化 １ ９０ 北方园艺ｚ０１３０２）：１８８～１９１ 和ＤＮＡ去甲基化等也都是现在的研究热点，国内外检 测ＤＮＡ甲基化的技术也应运而生，而且随着研究的不 断广泛、深入，新的研究方法层出不穷，实用的技术快速 被推而广之。其中ＭＳＡＰ技术逐渐成为主要应用的技 术，若与其它分子生物学方法如ＤＮＡ分子遗传标记、 ＤＮＡ重组技术、ＤＮＡ微阵列等结合起来进行综合研究， 将为在分子水平上揭示调控基因时空特异表达机理建 立起有力的技术平台，在研究功能基因、改良植物性状、 改变植物抗逆性性等方面发挥重要作用，从而使其在杂 种优势消除转基因沉默，研究功能基因，改良植物表型 性状，提高植物适应性等方面发挥重要作用。 参考文献 ［１］ＤａＮ Ｃ Ｇｕｌｄｂｅｒｇ Ｐ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｌｓ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｊ］．Ｂｉｏｇｅｍ— ｎｔｏｌｇｎｙ，２００３（４）：２３３—２５０． ［２］孙颖，葛锋，刘迪秋，等．植物中ＤＮＡ甲基化模式及其相关机制［Ｊ］． 植物生理学报，２０１１，４７（８）：７４５—７５１． Ｉｓ］Ｚｈａｎｇ Ｘ，Ｙａｚａｋｉ Ｊ，Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｅ—ｗｉｄｅ ｈｉｇｈ—ｒｅｓｏ— ｌｕｔｉｏｎ ｍａｐｐｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉ— ｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｃｅｌｌ，２００６，１２６：１１８９—１２０１． ［４］Ｓｕｚｕｋ Ｍ Ｍ，Ｂｉｒｄ Ａ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｌａｎｄｓｃａｐｅｓ：ｐｒｏｖｏｃａｔｉｖｅ ｉｎｓｉｇｈｔｓｆｒｏｍ ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｅｓ［Ｊ］．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ，２００８（９）：４６５—４７６． ［５３ Ｚｉｌｂｅｒｍａｎ Ｄ，Ｇｅｈｒｉｎｇ Ｍ，Ｔｒａｎ Ｒ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｕｎｃｏｖｅｒｓ ａｎ ｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＤ］．Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ，２００７，３９（１）：６１—６９． ［６３ Ｌｕ Ｇ Ｙ，Ｗｕ Ｘ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｂ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｅｄ ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｒａｐｅｓｅｅｄ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｅｉ Ｂｕｌｌ，２００６，５１ （２）：１８２－１９０． ［７］杨金兰，柳李旺，龚义勤，等．镉胁迫下萝ｂ基因组ＤＮＡ甲基化敏感 扩增多态性分析口］．植物生理与分子生物学学报，２００７，３３（３）：２１９—２２６． ［８］赵云雷，叶武威，王俊娟，等．ＤＮＡ甲基化与植物抗逆性研究进展 ［Ｊ］．西北植物学报，２００９，２９（７）：１４７９—１４８９． ［９］彭海，张静．胁迫与植物ＤＮＡ甲基化育种中的潜在应用与挑战［Ｊ］． 自然科学进展，２００９，１９０（３）：２４８—２５６． ［１ｏ］宋欣欣，刘宝．低氮水平下诱导的水稻ＤＮＡ甲基化变异［Ｄ］．长春： 东北师范大学，２００９． ［１１］王子成，马洪霞，何艳霞．重金属镉对拟南芥ＤＮＡ甲基化的影响口］． 植物生理学通讯，２００９，４５（２）：１１５—１１８． ［１２］高桂珍，应菲，陈碧云，等．热胁迫过程中白菜型油菜种子ＤＮＡ的甲 基化口］．作物学报，２０１１，３７（９）：１５９７—１６０４． ［１３］潘雅姣，傅彬英，王迪，等．水稻干旱胁迫诱导ＤＮＡ甲基化时空变化 特征分析［Ｊ］．中国农业科学，２００９，４２（９）：３００９—３０１８． ［１４］Ｗａｄｄｉｇｎｔｏｎ Ｃ Ｈ．Ｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｏｆ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９４２，１５０：５６３—５６５． ［１５］Ｈａｂｕ Ｙ Ｍ，Ｍａｔｈｉｅｕ Ｏ，Ｔａｒｉｑ Ｍ，ｅｔ ａ１．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｈｅｔｅｒｃｏｈｒｏｍａｔｉｎ［Ｊ］．ＥⅣ晒Ｏ Ｒｅｐ，２００６，７（１２）： １２７９—１２８４． ［１６］Ｗａｎｇ Ｍ Ｂ，Ｄｅｎｎｉｓ Ｅ Ｓ．ＳＰＴ５一ｌｉｋｅ，ａ ｎｅｗ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｉｎ ｐｌａｎｔ［Ｊ］．ＥＭ— ＢＯ Ｒｅｐ，２００９，１０（６）：５７３～５７５． ［１７］Ｌａｗ Ｊ Ａ，Ｊａｃｏｂｓｏｎ Ｓ Ｅ Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｇｎ，ｍａｉｎｔａｉｎｉｇｎ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ａｎｉｍａｌｓ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１１（１１）：２０４—２２０． ［１８］Ｂｏｙｋｏ Ａ，Ｋａｔｈｉｒｉａ Ｐ，Ｚｅｍｐ Ｆ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｇｅｎｅｒａｔｉｏｎａｌ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｔｈｅ 北方园艺２０１３（１２）：１８８～１９１ 专题综述 ｇｅｎｏｍｅ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎｐａｔｈｏｇｅｎ—ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ：Ｖｉｒｕｓ—ｉｎｄｕｃｅｄ ［３３］Ｋｅｌｋａｒ Ａ，Ｄｅｏｂａｇｋａｒ ｎ Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ａｓｓｅｓｓ ｔｈｅ ｆｕｌｌ ｇｅｎｏｍｅ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００７，３５（５）：１７１４—１７２５． ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅ ｕｓｉｇｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈ ［１９］Ｐｅｎｇ Ｈ，Ｚｈａｎｇ Ｊ．Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏｓｔｍｓｓｅｓ： ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｂａｓｅｄ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ａｐｐｒｏａｃｈ［Ｊ］．Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００９（４）：４１５—４２０． Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｂｒｅｅｄｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ ［３４］张莉，贾峰，张广乐，等．植物ＤＮＡ甲基化研究进展［Ｊ］．安徽农业科 Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００９，１４（４）：２６５—２７１． 学，２０１２，４０（６）：３２１８—３２２１． ［２０３ Ｄｏｎｇ ｘ Ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｑｕｉｒｅｄ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ ［３５３ Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ｊ Ｗ，Ｈａｒｄｉｎｇ Ｋ，Ｂｒｅｍｎｅｒ Ｄ Ｈ，ｅｔ ａＩ．ＨＰＬＣ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００１（４）：３０９—３１４． ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ａ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉａｃｌ ｆａｃｔｏｒｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ ［２１］Ｔｉａｎ Ｔｉａｎ，Ｗａｎｇ Ｓ Ｒ，ｗｕ Ｊ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｏｆ ＤＮＡ ｉＢｏｃｈｅｍ，２００５，４３：８４４—８５３． ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｓｓｅ￣Ｊ］．ＳｃｉｅｎｃｅＣｈｉｎａＣｈｅｎ￣ｓｔｒｙ，２０１１，５４（８）：１２３３—１２４３． ｒ３６］Ｘｕ Ｍ，Ｌｉ Ｘ，Ｋｏｒｂａｎ Ｓ＆ＡＦＬＰ—ｈａｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｈｔｉｏｎ ［２２３ Ｙａｎ Ｓ，Ｈｕａｎｇ Ｒ，Ｚｈｏｕ Ｙ，ｅｔ ａ１．Ａｐｔａｍｅｒ—ｂａｓｅｄ ｔｕｍ—ｏｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ 口］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｉ Ｒｅｐ，２０００，１８：３６１—３６８． ｆｏｕｒ－ｂｒａｎｃｈｅｄ ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｐｙｒａｚｉｎｅ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｔｈｒｏｍｂｉｎ ［３７］Ｈｅｒｍａｎ Ｊ Ｇ，Ｇｒａｆｔ Ｊ Ｒ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＰＣＲ：Ａ ｎｏｖｅｌ Ｐ（’Ｒ ａｓｓａｙ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ，２０１１，４７：１２７３—１２７５． ｆｏｒ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ＣｐＧ ｉｓｌａｎｄｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，１９９６，９３： ［２３］Ｆｅｎｇ Ｘ，Ｄｕａｎ Ｘ，Ｌｉｕ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｏｌｙｅｌｅｃｔｒｏ１ｙｔｅ ９８２１－９８２６． ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｅａｃｏｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ，ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｐｅｃｉｆｉｃ，ｒｅａｌｔｉｍｅ ＤＮＡ ［３８］吴春太，李维国，高新生，等．ＭＳＡＰ技术及其在橡胶树遗传育种研 ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００８，２４：１２１３８—１２１４１． 究中的应用前景［Ｊ］．贵州农业科学，２００９，３７（１１）：９－１４． ［２４］Ｆｅｎｇ Ｆ，Ｗａｎｇ Ｈ，Ｈａｎ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｏｃｎｊｕｇａｔｅｄ ｐｏｌｙｅｌｃｅｔｒｏｌｙｔｅ ａｓ ［３９］Ａｓｈｉｋａｗａ．Ｓｕｒｖｅｙｉｎｇ ＣｐＧ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｔ ５＇－ＣＣＧＧ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅｓ ｏｆ ａｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｏｒ ｏｃｎｖｅｎｉｅｎｔ ｄｅｔｃｅｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｊａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ， ｒｉｃｅ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｔ Ｂｌｏｔ，２００１，４５：３１—３９． ２００８，１３０：１１３３８－１１３４３． ［４ｏ］张燕，陈波．ＤＮＡ甲基化敏感扩增多态性技术及其在作物遗传研究 ［２５］Ｂａｒｅｙｔ Ｓ，Ｃａｒｅｌｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ＤＮＡ 中的应用［Ｊ］．西昌学院学报，２００９，２３（４）：７－１１． ［Ｊ］．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎ ，２００８，４７｛１８１—１８４． ［４１３郑鑫，马晓岗，迟德钊，等．高活力水稻种子萌发过程中ＤＮＡ甲基化 ［２６］Ｎｏｍｕｒａ Ａ，Ｔｓｉｎａｋａ Ｋ，Ｏｋａｍｏｔｏ Ａ Ｏｓｍｉｕｍ ｃｏｍｐｌｅｘａｆｉｏｎ ｏｆ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ 变化的ＭＳＡＰ分析［Ｊ］．青海大学学报，２００９，２７（９）：１８—２１． ＤＮＡ：ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｅｓ ａｄｊａｃｅｎｔ ｔｏ ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ ５一ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ［Ｊ］． ［４２］Ｌｉｕ Ｂ，Ｂｒｕｂａｋｅｒ Ｃ Ｌ，Ｍｅｒｇｅａｉ Ｇ，ｅｔ ａ１．Ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｉｎ ｃｏｔｔｏｎ ｉｓ ｉＢｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ，２００９，２０：６０３—６０７． ｎｏｔ ａｃｃｏｍｐａｎｉｄｅ ｂｙ ｒａｐｉｄ ｇｅｎｏｍｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ［Ｊ］．Ｇｅｎｏｍｅ．２００１，４４：３２１—３３０． ［２７３ Ｏｋａｍｏｔｏ Ａ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ—ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｏｓｍｉｕｍ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎｕｃｌｅｏ— ｒ４３］Ｘｕ Ｍ，Ｌｉ Ｘ，Ｋｏｒｂａｎ Ｓ Ｓ ＡＦＬＰ—ｂａｓｄｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｏ－ｔｉｄｅｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，２００７，２６：１６０１—１６０４． ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｒｅｐ，２０００，１８：３６１—３６８． ［２８］Ｏｋａｍｏｔｏ Ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏｗａｒｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ［４４］Ｃｅｒｖｅｒａ Ｍ Ｔ，Ｒｕｉｚ—Ｇａｒｃｉａ Ｌ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ—Ｚａｐａｔｅｒ Ｊ ｈａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ ａｎａｌｙｓｉｓ口］．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ，２００９（７）：２１—２６． ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｂａｓｅｄ ｏｎｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＡＦＬＰ ［２９］Ｙａｍａｄａ Ｈ，Ｔａｎａｂｅ Ｋ，Ｎｉｓｈｉｍｏｔｏ Ｓ．Ｐｈｏｔｏｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｆｔｅｒ ｍａｒｋｅｒｓ［Ｊ］．Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２００２，２６８：５４３—５５２． ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＤＮＡ ｄｕｐｌｅｘｅｓ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ ｏｎ ｇｏｌｄ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ： ［４５］Ｐｅｒａｚａ－Ｅｃｈｅｖｅｒｆｉａ Ｓ，Ｈｅｒｒｅｒａ—Ｖａｌｅｎｃｉａ Ｖ Ａ，Ｋａｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｄｉｓｃｒｉｉｍｎａｔｉｏｎ ｏｆ ５－ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｏｄｉｆｉａｃｔｉｏｎ ｉｎ ＤＮＡ［Ｊ］． ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｒｎｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｅｄ ｂａｎａｎａ ｐｌａｎｔｓ ｕｓｉｇｎ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ—－ Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ，２００８（６）：２７２—２７７． ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒｐｈｉｓｍ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ ＳＣｉ，２００１，１６１：３５９—３６７． ［３Ｏ］Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ Ｋ Ｍ，Ｂｅｒｍｉｎｇｈａｍ Ｅ Ｎ，Ｂａｓｓｅｔｔ Ｓ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｇｌｏｂａｌ ＤＮＡ ［４６］Ｍａｔｔｈｅｓ Ｍ，Ｓｉｎｇｈ Ｒ，Ｃｈｅａｈ Ｓ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｎ。ｉｌ ｐａｌｍ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌ— ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ ｂｙ ＨＰＬＣ ｕｓｉｇｎ ｌｏｗ ａｍｏｕｎｔｓ ｏｆ ＤＮＡ［Ｊ］：Ｂｉｏｔｅｃｈ— ｔｕｒｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｎｔｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｂｙ ＡＦＬＰｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ－ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｅｌｌ—－ ｎｏｌ，２０１０（６）：１１３—１１７． ｚｙｍｅｓ［］］．Ｔｈｅｏｒ Ａｐｐｌ Ｇｅｎｅｔ，２００１，１０２：９７１—９７９． ［３１］Ｚｈａｎｇ Ｊ Ｊ，Ｚｈａｎｇ Ｌ，Ｚｈｏｕ Ｋ，ｅｔ ａ１．Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｇｌｏｂａｌ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ［４７］Ｊｏｙｃｅ Ｓ Ｍ，Ｃａｓｓｅｌｌｓ Ａ ｃ Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｉｒａ ｐｏｔａｔｏ ｍｉｃｒｏｐｌａｎｔｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｉｎ ｂｙ ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｕｌｔｒａ ｈｉｇｈ——ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓ，２００２，７０：１２５—１３７． ｔａｎｄｅｍ ＩＴ￣ＳＳ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ［Ｊ］．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０１１，４１３：１６４—１７０． ［４８］付胜杰，王晖，冯丽娜，等，叶锈菌胁迫下的小麦基因组ＭＳＡＰ分析 ［３２］Ｓｈｉ Ｘ，Ｔａｎｇ Ｃ，Ｚｈｏｕ Ｄ，ｅｔ ａ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣｐＧ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ［Ｊ］．遗传，２００９，３１（３）：２９７—３０４． ｕｓｉｇｎ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ ｗｉｔｈ ｔａｒｇｅｔ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎｐａｄｌｏｃｋ ｐｒｏｂｅ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ Ｃｈｉｍ ［４９］王春国，古瑜，陈成彬，等，不同倍性西瓜基因组ＤＮＡ甲基化水平与 Ａｃｔａ，２０１０，４１１：１１８７一ｌ１９４． 模式的ＭＳＡＰ分析［Ｊ］．分子细胞生物学报，２００９，４２（２）：１１９—１２６． ＰＩａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＣＨＥＮ ｘｉ，ＷＡＮＧ Ｒｕｉ，ＤＩＮＧ Ｇｕｏ－ｈｕａ （Ｈｅｉｌｏｎｇｉｉａｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ，Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｒｂｉｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｒｂｉｎ，Ｈｅｉｌｏｎｇｉｉａｎｇ １５００２５） Ａｂｓ仃ａｃｔ：Ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ａ ｄｅｔａｉｌ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ，ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｓｓｕｅｓ ａｂｏｕｔ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｔ ｈｏｍｅ ａｎｄ ａｂｒｏａｄ ｗｅｒｅ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ；ｇｅｎｅｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｔｒｅｓｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓａｌｔ ｓｔｒｅｓｓ。Ｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ。 ｈｅａｖｙ ｍｅｔａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｈｅａｔ ａｎｄ ｄｒｏｕｇｈｔ ｓｔｒｅｓｓ ａｎｄ ｓｏ ｏｎ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ．Ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｗｅｒｅ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ，ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｃ ｔｈｅｏｒｙ，ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ａｎｄ ｅｘａｍｐｌｅｓ ｏｆ～ ＡＰ；ｔｈｅ ｐｌａｎｔ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｌｓｏ ｐｒｏｓｐｅｃｔｅｄ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ＤＮＡ；ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ；ｐｒｏｇｒｅｓｓ；ｍｅｔｈｏｄ；ＭＳＡＰ ｌ９１