江苏农业科学２０１１年第３９卷第５期 －－——３９３－－—— 陈 勇，陶德欣，鲁黎明．ＤＮＳ法测定烟草还原糖条件的优化［Ｊ］．江苏农业科学，２０１１，３９（５）：３９３—３９５ ＤＮＳ法测定烟草还原糖条件的优化 陈 勇，陶德欣，鲁黎明 （四川农业大学农学院，四川成都６１１１３４） 摘要：常规ＤＮＳ法测定烟草还原糖，具有简便快速的特点；然而，与伯川法（经典方法）相比测定结果相对误差较 大（２３．７８％）。本研究对ＤＮＳ法进行了条件优化，对待测液进行了除色素与除蛋白质处理。结果表明，除色素干扰 后，还原糖含量测定结果与伯川法相比，相对误差下降为８．０７％；除蛋白质干扰后，测定结果与伯川法相比，相对误差 仅为３．４３％。改进后的ＤＮＳ法测定烟草还原糖准确、快速、稳定，数据重现性好。 关键词：ＤＮＳ法；伯川法；烟草还原糖；活性炭；蛋白质；色素 中图分类号：ＴＳ２４１ 文献标志码：Ａ 文章编号：１００２—１３０２（２０１１）０５—０３９３—０３． 烟叶中的还原糖含量是反映烟草品质的重要指标 。 目前，测定还原糖的方法有多种，如经典的铜系分析法 、 １材料与方法 ３，５一二硝基水杨酸比色法（ＤＮＳ法）、高效液相色谱法、连续 １．１试验材料 流动分析法 。 以及近红外法 等。铜系分析法具有准确 选取烟草品种云８５烤后中部烟叶，烘干粉碎后过４Ｏ目 度高、重现性好等优点，但流程长、步骤多、操作繁琐费时，且 筛，充分混匀备用。 要求严格，试剂及水电消耗大，并且只能用于常量分析 。 １．２仪器 ＤＮＳ法是最常用的方法 ，具有简便、快捷、易操作、耗费试 ｕＶ一１１００型紫外一可见分光光度计，旋转蒸发器，恒温 剂少、分析速度较快的特点；但稳定性较差，准确度不够高，易 水浴锅（上海亚荣生化仪器厂），真空泵，万用电炉，具塞刻度 受提取液中其他物质如色素、蛋白质等的干扰。高效液相色 试管，Ｇ４型烧结玻璃坩埚等。 谱法、连续流动分析法、近红外法等虽然准确度高、操作方便； １．３试剂 但仪器设备价格昂贵，不适合常规测定使用。因此，针对 ２００ ｇ／Ｌ中性醋酸铅溶液、２００ ｇ／Ｌ草酸钾溶液、费林试 ＤＮＳ法存在的问题，对其进行了测定条件的优化，旨在找到 剂、高锰酸钾标准溶液、硫酸铁溶液、邻菲罗啉指示剂（配制 一种准确、有效、快速的糖类物质测定方法。 方法参见《烟草化学》 ），ＤＮＳ试剂 等。 １ ｍｓ／ｍＬ葡萄糖标准品、０．２５ ｍｓ／ｍＬ葡萄糖标准品、活 性炭、定量滤纸。所用试剂均为ＡＲ级，所用水均为蒸馏水。 收稿日期：２０１０—１１—２８ １．４ 方法 作者简介：陈勇（１９８７一），男，四川成都人，科研助理。Ｅ～ｍａｉｌ １．４．１伯川法参照烟草行业标准ＹＣ／Ｔ ３２—１９９６ 。 ｃｈｅｎｊａｎｅ１９８７＠ｆｏｘｍａｉｌ．ＣＯｒｎ。 １．４．２常规ＤＮＳ法 通信作者：鲁黎明，男，博士，副教授。Ｅ—ｍａｉｌ：ｌｏｕｉｓ—ｌｕｌｉｍｉｎｇ＠１２６ １．４．２．１标准曲线的绘制取５支２５ ｍＬ具塞试管，分别加 入０，０．１、０．２、０．４、０．６ ｍＬ的１ ｍｇ／ｍＬ葡萄糖标准品，补水至 ２ ｍＬ，再加入１．５ ｍＬ ＤＮＳ试剂，塞好试管，沸水浴７ ｍｉｎ，以空 （上接第３９２页） ３结论 本研究结果表明，绿茶韧性饼干的最佳配方为：８００目的 超微绿茶粉添加量占总材料的１．８％，碳酸氢钠和碳酸氢铵 的比例２：１，烘烤温度为上温１８０℃、下温１６０ ｏＣ。按照此配 方及工艺，可制得色泽、口感、断面结构、外形等方面均较好的 绿茶饼干（图１）。 参考文献： Ａ．空白试验饼干 Ｂ．最佳配ｌ方饼干 图１ 最佳配方和空白试验制得的饼干样品 ［１］林楠，夏杨毅，鲁言文．饼干品质评价的研究进展［Ｊ］．粮油加 工艺的研究［Ｊ］．粮食与饲料工业，２００３（３）：４０—４１． 工，２００９（３）：１０２—１０５． ［４］李秀娟．食品加工技术［Ｍ］．北京：化学工业出版社，２００８：８５． ［２］张正竹．超微绿茶粉加工技术［Ｊ］．茶业通报，２００６，２８（１）：ｌ９． ［５］吴素萍．茶味饼干生产技术探讨［Ｊ］．食品科技，２００２（８）：１２— ［３］陆晓滨，董贝磊，李敬龙，等．酶法生产无残留二氧化硫韧性饼干 １３． －－——３９４・－—— 江苏农业科学２０１１年第３９卷第５期 １所示。由表１可见，由伯川法经５次平行测定得出的含糖 量为２４．５２％；常规ＤＮＳ法（标准曲线为：Ｙ＝１．４０２ｘ～ ０．００１ ７，ｒ２＝０．白为参比，测定５４０ ｎｍ波长条件下吸光值 线，并计算得出一元线性回归方程。 １．４．２．２烟样还原糖含量的测定，绘制标准曲 取８０～１００ ｍｇ烟样于 ９９９ ９）则为３０．３５％。由于伯川法是常规测糖 １００ ｍＬ容量瓶中，用蒸馏水定容，置于５０℃水浴锅中水浴 ４０ ｍｉｎ，不时摇匀，趁热过滤得浸提液。取待测液及蒸馏水 （对照）各２ ｍＬ于２５ ｍＬ具塞试管中，加入１．５ ｍＬＤＮＳ显色 剂，塞好试管，沸水浴７ ｍｉｎ，流水冷却后在分光光度仪５４０ ｎｍ 波长条件下进行比色，记录吸收值Ｄ，计算得出还原糖含量。 操作时间控制在２ ｈ内。 方法中最经典的方法，所以，常规ＤＮＳ法测定结果与伯川法 相比相对误差为２３．７８％，相对误差较大。由表１还可以看 出，这２种方法重现性均较好，但是ＤＮＳ法测定烟草还原糖 的准确性较差，说明这种方法可能存在某些因素的干扰。 表１ ２种测定方法测定结果的比较 １．４．２．３常规ＤＮＳ法回收率的测定取１ ｍｅ／ｍＬ葡萄糖标 准品，分别配制０．０５、０．１、０．２、０．３ ｍｅ／ｍＬ的葡萄糖溶液。 取５支２５ ｍＬ具塞试管编号，分ＩＩ￣ＩＩ入１ ｍＬ“１．４．２．２”中所 制备的浸提液，一号管加入１ ｍＬ蒸馏水，另外４管分别加入 １ ｍＬ各浓度葡萄糖溶液后用ＤＮＳ法测定。流水冷却后以一 号管为参比溶液比色记录吸收值Ｄ，通过测定还原糖含量，计 算ＤＮＳ法在烟草提取液背景下的回收率。另取５支试管，分 别加入０、０．１、０．２、０．４、０．６ ｍＬ的１ ｍｇ／ｍＬ葡萄糖标准品，补 蒸馏水至２ ｍＬ，以空白为参比，使用ＤＮＳ法测定糖含量，计算 回收率。 １．４．３待测液色素的去除 １．４．３．１活性炭脱色及回收率测定配制０．２５ ｍｅ／ｍＬ标 准葡萄糖溶液（与烟样待测液还原糖浓度相近），取该标准糖 溶液２０ ｍＬ于６个１００ ｍＬ小烧杯中，分别加入５、１Ｏ、２５、５０、 ７５ ｍｇ活性炭后，稍作摇动，静置片刻后过滤得提取液。再使 用ＤＮＳ法测定还原糖的含量，计算回收率，还原糖回收率在 ９５％以上的活性炭处理量可用于烟样水提液的脱色处理。 １．４．３．２ 活性炭脱色及还原糖含量测定称取烟样１６０— ２００ ｍｇ，放入２００ ｍＬ容量瓶中，蒸馏水定容，置于５Ｏ℃水浴 锅中水浴４０ ｍｉｎ，不时摇动，趁热将水提液过滤。取该浸提液 ２０ ｍＬ于６个１００ ｍＬ小烧杯中，分别加入经“１．４．３．１”确定 的活性炭量，稍作摇动，静置片刻后过滤得提取液，使用ＤＮＳ 法测定还原糖含量。 １．４．４待测液蛋白质的去除 １．４．４．１蛋白质去除称取烟样１６０～２００ ｍｇ，放入１００ ｍＬ 容量瓶中，蒸馏水定容。置于５０℃水浴锅中水浴４０ ｍｉｎ，不 时摇动，趁热将水提液过滤，用少量５０℃热水洗涤３次，加入 ５ ｍＬ醋酸铅溶液，澄清后过滤于三角瓶中，用少量５０℃热水 洗涤３次，然后向三角瓶中加入草酸钾溶液５ ｍＬ，使过量的 醋酸铅沉淀。静置片刻，用草酸钾溶液检查上层清液中铅离 子是否沉淀完全，过滤后定容至２５０ ｍＬ，即得待测液，用ＤＮＳ 法测定待测液的还原糖含量。 １．４．４．２回收率测定配制０．５ ｍｅ／ｍＬ标准葡萄糖溶液 （定容至２５０ ｍＬ后与烟样水提液还原糖量相近）１００ ｍＬ，加 入５ ｍＬ醋酸铅溶液，使用“１．４．４．１”方法进行除蛋白质处 理，然后过滤定容至２５０ ｍＬ，即得待测液，用ＤＮＳ法测定待测 液的还原糖含量，计算回收率。 ２结果与分析 ２．１常规ＤＮＳ法与伯川法测定结果的比较 为了明确常规ＤＮＳ法与伯川法在测定烟草还原糖方面 的差异，采用这２种方法对烟草还原糖进行了测定，结果如表 ２．２常规ＤＮＳ法测定烟草还原糖干扰因素的探索 为了探索常规ＤＮＳ法测定烟草还原糖的干扰因素，采取 测定回收率的方法，向烟草水提液及蒸馏水中添加不同用量 的糖，然后再测定待测液的含糖量，结果如表２所示。 表２ ２种背景下ＤＮＳ法回收率测定结果 由表２可以看出，这２种情况下所获得的回收率有明显 不同。在蒸馏水的背景下，使用纯糖溶液测得的回收率较好， 均在９９％一１００．６７％之间。而在烟样背景下，回收率则变化 较大，除加入０．１ ｍｇ糖量的处理组以外，其余的回收率都在 １０５％以上。由此可见，ＤＮＳ法测定还原糖时，烟草水提液中 确实存在某种物质的干扰，使得测定结果偏离真实值。 ２．３ ＤＮＳ法的改良 ２．３．１色素的去除 ２．３．１．１ 活性炭处理后的回收率 由于烟草中含有丰富的 色素，因此烟样水提液呈黄色。测定过程中黄色背景可加深 反应后的颜色而对结果造成干扰。因此，采用不同用量的活 性炭对待测液进行脱色处理。由于活性炭脱色的同时对糖也 有一定的吸附 ，因此，在用活性炭脱色之前，必须确定其用 量，以确保在脱色的同时尽量减少对糖的吸附。由表３可以 看出，标准糖溶液经５个梯度活性炭量处理后，回收率总体上 呈现递减的趋势，表现出糖的吸附量与活性炭用量成正比关 系。从回收率来看，４个处理均在９５％～１０５％的范围内，只 有最后一个处理回收率低于９５％，因此，活性炭不可用于烟 草色素的脱色处理。 ２．３．Ｉ．２脱色后还原糖测定结果采用上述４个处理的活 性炭用量，对烟草待测液进行脱色处理，然后再用ＤＮＳ法测 定还原糖的含量，结果见表４。由表４可以看出，随着活性炭 用量的加大，烟样含糖量的测定结果降低，测定值更接近伯川 法测定的结果。当活性炭的用量为５０ ｍｇ时，含糖量测定结 果为２６．５０％，比常规ＤＮＳ的测定结果降低了３．８５百分点， 陈勇等：ＤＮＳ法测定烟草还原糖条件的优化 －－——３９５—－—— 表３活性炭处理标准糖溶液后的回收率 加入炭量 含糖量平 含糖量标 变异系数 与伯川法比 （ｍｇ） 均值（％） 准差（％） （％） 相对误差（％） 与伯川法测定结果比较接近，相对误差仅为８．ｏ７％，且重现 性较好，在原来基础上已有较大改进。同时在试验中５０ ｍｇ 活性炭用量处理烟样提取液后为无色，可以排除由色素产生 的黄色背景所造成的干扰。因此，把脱色时的活性炭用量确 定为５０ ｍｇ。 ２．３．２蛋白质的去除 ２．３．２．１测定结果烟草待测液中的蛋白质，也可能对测定 结果产生影响。因此，对烟草水提液进行脱蛋白质处理后，再 用ＤＮＳ法测定还原糖含量，结果见表５。由表５看出，经脱蛋 白处理后的含糖量平均测定值为２５．３６％，与伯川法相比相 对误差为３．４３％，在常规法基础上还原糖的含量降低了 ４．９９百分点。平行测定５次，测定结果变异系数小，重现性较 好，能满足分析要求。 ２．３．２．２ 回收率测定用配制的标准糖溶液对经蛋白质处 理的ＤＮＳ法进行了回收率测定，结果见表６。由表６可以看 出，３次平行的回收率测定结果之间变异系数只有２．１５％，标 准差２．１３５ ６％，平均回收率为９９．３９％，表明该方法测定结 果较准确，重现性好，是一种可靠的方法。 表５除蛋白质后的含糖量测定结果 平行测定值（％） 平均值 标准差 变异系数 １ ２ ３ （％） （％） （％） ９８．５６ １０１．８２ ９７．８ ９９．３９ ２．１３５ ６ ２．１５ ３结论与讨论 ＤＮＳ法是测定还原糖最简捷常用的方法，然而，常规的 ＤＮＳ法应用于烟草还原糖含量测定时，偏差较大。回收率测 定的结果表明待测液中有干扰物质存在。本研究通过对烟草 待测液进行脱色素与脱蛋白质处理，较大地提高了ＤＮＳ法测 定烟草还原糖含量的准确性，取得了较为理想的结果。 烟草中含有较多色素，在比色测定过程中，烟草色素形成 淡黄色背景，可以使最终测定结果偏大。因此，对烟样待测液 用５０ ｍｇ活性炭进行了脱色素处理，再用ＤＮＳ法测定含糖 量，其结果为２６．５０％，与伯川法相比误差为８．０７％。由此可 见，色素在常规ＤＮＳ法测定烟草还原糖中，对偏高结果的贡 献并不是很大。但该方法能吸附所有色素，回收率可达 ９５％，与常规ＤＮＳ法相比有较大的改进，测定结果更准确，测 定精度更高。同时该方法简便快速，杂质干扰较小，效果明 显，重现性较好，在还原糖测定中不失为一种可行的方法。 烟草待测液中的蛋白质也可能干扰测定结果，因此，对待 测液进行脱蛋白质处理后，再用ＤＮＳ法测定含糖量，结果为 ２５．３６％。该测定结果与伯川法相对误差在５％以内，变异系 数较小，重现性好，与伯川法一致性较好，符合分析要求。虽 然与常规ＤＮＳ法相比，增加了除蛋白过程，但是测定结果与 伯川法非常接近，适合用于常规分析。改良后的方法与经典 的伯川法相比，简化了测定过程，节省了大量时间，也减少了 试剂的耗费量，提高了效率。 本研究还进行了对待测液既除色素又除蛋白质的尝试； 然而，结果表明该方法流程长，糖损失较多，操作繁琐，与快速 测定的要求不符，因此不予采用。此外，可能还有一些物质在 比色波长５４０ ｎｍ处有一定的吸收值，也会使测定结果偏大， 对这些影响因素，尚有待于进一步分析。 参考文献： ［１］罗志刚，曾满枝，凌晨，等．３，５一二硝基水杨酸比色法测定烟 草中水溶性总糖［Ｊ］．中国烟草科学，２０００（２）：３４—３６． ［２］刘国顺．烟草栽培学［Ｍ］．北京：中国农业出版社，２００３． ［３］肖协忠．烟草化学［Ｍ］．北京：中国农业科学技术出版社，１９９７． ［４］烟草种植编写组．烟草化学与分析［Ｍ］．北京：中国财政经济出 版社，１９９２． ［５］ＹＣ／Ｔ ３２一ｌ９９６烟草及烟草制品水溶性糖的测定：芒森・． 沃克法［ｓ］．北京：国家烟草专卖局，１９９６． ［６］彭军仓，张迎新，胡喜怀．用流动分析仪测定烟用香料中的还原 糖［Ｊ］．烟草科技，２００３（５）：２４—２５，４２． ［７］ＹＣ／Ｔ １５９－－２００２烟草及烟草制品水溶性糖的测定：连续流动 法［ｓ］．北京：国家烟草专卖局，２００２． 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