荧光微球标记偶联剂的影响--标记过程微球粒径大小及分散性对试剂条精密度的影响

标记过程微球粒径大小及分散性对试剂条精密度的影响

1. 实验方案

1.1. EDC及NHS的配制：使用50mM 的MES（pH6.0）将EDC制成0.5、1、2、3、4、5、6、7mg/mL，将NHS配

制成1、2、4、6、8、10、12、14mg/mL。

1.2. 分别各取100ul BansLab微球（固含量为1%）即1mg，放入8个离心管中。 1.3. 加入400ul的MES（pH6.0）稀释后进行离心换液（测粒径及分散性） 1.4. 加入500ul的MES重悬微球，超声分散（测粒径及分散性）

1.5. 加入EDC和NHS进行活化，按下表加入相应的EDC及NHS的量各20ul 实验序号 1 2 3 4 5 6 7 8 1.6. 活化30min后，离心去除MES

1.7. 加入偶联缓冲液重悬微球，超声分散（测粒径及分散性） 1.8. 在每管中分别加入75ug的鼠单克隆抗体（以PSA为例），迅速混匀后震荡反应1h（测粒径及分散性） 1.9. 在每管中加入封闭液10ul，封闭1h。（测粒径及分散性） 1.10. 离心，换成标记抗体保存液，超声分散。（测粒径及分散性） 2. 实验结果

2.1. 粒径检测结果及分析 微球量 100ul，1mg 100ul，1mg 100ul，1mg 100ul，1mg 100ul，1mg 100ul，1mg 100ul，1mg 100ul，1mg EDC/NHS浓度 EDC 0.5mg/mL 20ul；NHS 1.0mg/mL 20ul EDC 1.0mg/mL 20ul；NHS 2.0mg/mL 20ul EDC 2.0mg/mL 20ul；NHS 4.0mg/mL 20ul EDC 3.0mg/mL 20ul；NHS 6.0mg/mL 20ul EDC 4.0mg/mL 20ul；NHS 8.0mg/mL 20ul EDC 5.0mg/mL 20ul；NHS 10.0mg/mL 20ul EDC 6.0mg/mL 20ul；NHS 12.0mg/mL 20ul EDC 7.0mg/mL 20ul；NHS 14.0mg/mL 20ul 离心后换偶联实离心换液 活化30min后 偶联1h后 封闭1h后 离心换保存液 EDC/N液 验HS的序粒径粒径粒径粒径粒径粒径浓度 PDI PDI PDI PDI PDI PDI 号 大小 大小 大小 大小 大小 大小 原始0 226.2 0.026 —— —— —— —— —— —— —— —— —— —— 微球 1 0.5/1 218 0.124 220 0.096 216 0.079 284 0.416 233 0.118 256 0.122 2 1/2 221 0.094 218 0.099 216 0.22 299 0.389 267 0.14 252 0.14 3 2/4 224 0.131 234 0.158 220 0.105 273 0.322 259 0.248 255 0.123 4 3/6 218 0.093 355 0.34 224 0.139 452 0.587 304 0.297 280 0.226 5 4/8 217 0.14 387 0.479 229 0.045 358 0.377 278 0.152 250 0.164 6 5/10 224 0.13 391 0.525 223 0.098 732 0.921 353 0.424 325 0.279 7 6/12 224 0.119 416 0.614 224 0.079 875 0.94 675 0.769 479 0.552 8 7/14 235 0.097 354 0.445 228 0.234 891 0.998 391 0.507 307 0.296

结果说明：正常的鼠IgG粒径大小为约5-15nm的椭圆形球体，如果抗体均匀的标记到微球表面，则微球的体积应相应的增加约10-30nm。参数PDI反应了微球的分散性，PDI越小则表示分散性越好，在PDI≤0.050时则说明是完全的单分散；0.050≤PDI＜0.200时说明分散性良好；PDI≥0.200时，说明微球分散性不好，有聚集的现象。

从结果中来看，EDC/NHS的浓度对粒径及PDI的影响是比较大的，浓度越大，粒径越大，分散系数PDI就越大，分散性就越不好。从以上结果中还可以清楚的得知，在抗体的标记过程中偶联缓冲液、偶联过程、封闭过程到最终的保存液对微球的粒径及分散性均有一定的影响，所以在标记的过程中应重点优化这些过程。当然，除此之外，离心力的大小及超声过程也有所影响，需要标记人员熟练操作。 2.2. 制作成试剂条后检测精密度

按照工艺制作成试剂条后，用中浓度的PSA样品检测。每种标记的微球抗体检测10个重复，计算检测结果T/C的精密度，结果如下： 离心换保存液 实验EDC/NHS粒径AV SD CV% 序号 的浓度 粒径大小 PDI 增加 0 原始微球 226 —— —— —— —— 1 0.5/1 256 0.122 30 4.19 0.321 7.7% 2 1/2 252 0.14 26 6.02 0.258 4.3% 3 2/4 255 0.123 29 10.32 1.113 10.8% 4 3/6 280 0.226 54 22.83 3.821 16.7% 5 4/8 250 0.164 24 17.21 1.000 5.8% 6 5/10 325 0.279 99 15.68 1.804 11.5% 7 6/12 479 0.552 253 32.44 6.739 20.8% 8 7/14 307 0.296 81 21.47 1.881 8.8% 从结果中来看，EDC/NHS的浓度对粒径及PDI的影响是比较大的，浓度越大，粒径越大，分散系数PDI就越大，最终做成试剂条进行检测时，精密度越不好；反之，粒径适中，分散系数PDI越小，则精密度越好。

注：精密度的影响因素较多，以上结果仅对本次实验结果负责！！！

3. 实验结论

众所周知，抗体的标记工艺对后期的工艺开发具有重要的意义，抗体如果标记得不好，后续的工作将很难做好，所以抗体的标记对每个做诊断试剂的研发人员来说都是极其重要的。而抗体标记的工序相对复杂，涉及液体配方较多，如何监控每个工序及液体配方对最终标记结果的影响将显得尤为重要。而在进行最终测试之前，微球的粒径大小及其分散性（PDI）将是一个非常重要的参数，它们可以监控微球标记抗体的过程，让研发人员及时发现标记过程的重要影响因素，进而缩短优化时间，并能得到最优的标记工艺。