摘要 干旱是制约植物生长发育的主要逆境因素。以生长7天并干旱5天的小麦幼苗作原料，研究探讨了干旱对其生理生化的影响。结果表明：在干旱胁迫下，小麦体内的各项指标都有明显变化，如：pro、POD、PPO、MDA、H2O2 、GSH等。 关键词 干旱胁迫、小麦、pro，POD，PPO，MDA，H2O2 ，GSH
水循环与水资源分配格局的改变导致干旱半干旱区域不断扩散, 干旱环境不断恶化。植物叶片光合生理过程不仅是植物生长最为基本的过程, 而且对环境变化极为敏感。干旱常常被认为是自然条件下限制光合作用, 影响植物生产力的最重要因子之一
【1】
。2010年以来干
旱不断，西南地区干旱范围不断扩大，逐步从云南扩展到四川、贵州、广西西部等地，受灾人数超过5000万人。在重庆农作物受害270万亩，其中重旱65万亩、干枯9万亩、水田缺水230万亩、旱地缺墒150万亩。在四川农作物受灾面积51.1万公顷，成灾面积24.8公顷，绝收面积5.7万公顷。在云南3000多万亩农作物受灾，小春作物基本绝收。正因为如此，今年国家加大了对干旱的治理以及对作物抗旱的研究。现以小麦为原料，来确定干旱胁迫对作物生理生化的影响，一次来找到相应的指标并加以解决。 一、 材料与方法
（一）、材料、试剂、仪器
1、材料：干旱胁迫下处理的小麦幼苗。
2、试剂：0.1% HgCl2 ，TTC，3%磺基水杨酸（SSA），冰乙酸，
茚三酮，PBS(pH=7.8) ，0.6%TBA（用0.6% TCA配制）， PBS (pH=6.8，内含1mMHA)，0.1%Ti(SO4)2 [用20%(v/v) H2SO4配制] ，PBS, （pH=5.8,内含0.１mmol/ LEDTA, 1%PVP）， POD反应混合液（10 mmol/L愈创木酚，5 mmol/L H2O2,用PBS溶解），PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）5%三氯乙酸，PBS (pH=7.7) ，4 mM DTNB (用0.1M pH=6.8PBS现配)。
3、仪器：分光光度仪，离心机，试管，微量加样器，研钵等。 （二）、方法
1、Pro: 脯氨酸含量的测定采用磺基水杨酸法 。
（1）Pro的提取：分别取0.1 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL
3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 3% SSA洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。 （2）测定：上清液各2 mL →分别加入2 mL冰乙酸和2 mL茚三酮
试剂→煮沸15 min→冷却后→5000 rpm离心10 min（若没沉淀可略此步骤） →分别测定A520
（3）计算：Pro content=A520/(E *W*L)*V显*V总/V(mmol.g-1FW) 2、抗氧化酶（POD、POP）
（1）抗氧化酶的提取：分别取0.5 g实验材料→加入少许石英砂
和3 ml提取液（50mmol/L PBS, pH5.8,内含0.１mmol/ LEDTA, 1%PVP） → 充分研磨 →转入离心管中→用2 ml提取液洗研钵→ 5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 ml →用于
测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。 （2）POD测定：取POD反应混合液（10 mmol/L愈创木酚，5 mmol/L
H2O2,用PBS溶解）3.00 ml，加入酶液100 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应3 min时的A470。 （3）PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，用PBS
溶解）2.8 ml，加入酶液0.2 ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，读出反应 2 min时的A410。
以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U）。 （4）计算：
POD activities = A470/(E *W*t)*V显*V总/V用
(mmol.g-1FWmin-1)
PPO activities = A410/(0.01 *W*t)*V总/V用(U.g-1FW) 3、GSH
(1)GSH的提取：分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3 mL 5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2 mL 5% TCA洗研钵→ 5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。 (2)测定：上清液各1 mL → 分别加入1 mL0.1M PBS (pH=7.7) → 0.5 mL 4 mM DTNB (用0.1M pH6.8PBS现配，空白用此PBS代替) → 25 ℃5 min→测定A412。 （3）计算：
GSH content= A412/(E *W*L)*V显*V总/V用(mmol.g-1FW) 4、H2O2
(1)H2O2提取：分别取0.5 g实验组和对照组→加入3 mL 50 mM PBS (pH=6.8，内含1mM HA)和少许石英砂→充分研磨→用2 mL PBS洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。 (2)测定：分别取上清液各3 mL →加入0.1%Ti(SO4)2 [用20%(v/v) H2SO4配制] 1 mL→摇匀→ 5000 rpm离心10 min → OD410 (3)计算：
H2O2 content= A410/(E *W*L)*V显*V总/V用(mmol.g-1FW) 5、MDA与可溶性糖
(1)MDA提取：分别取0.5 g实验组和对照组→加入3 mL 50mM PBS (pH=7.8)和少许石英砂→充分研磨→用2 mL PBS洗研钵→5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 mL。
(2)测定：分别取上清液各2 mL →加入0.6%TBA（用0.6% TCA配制） 2 mL→煮沸12 min→冷却后→5000 rpm离心10 min →分别测定OD450和OD532 (3)计算：
OD450=C1*85.4
OD532=C1*7.4+155000*C2 C1(mmol/L)=11.71*OD450
C2(mmol/L)=6.45*OD532-0.56*OD450 C1表示可溶性糖的浓度，C2表示MDA的浓度
二、 结果及分析
【2】
（一）脯氨酸积累
实验组 对照组 OD520 3.00 0.218 含量(mmol.g-1FW) 15.432 1.121 如上表所示：小麦幼苗叶片Pro 含量由于干旱胁迫而有所上升。在干旱条件下，而造成水分缺失的渗透胁迫，就会引起脯氨酸的积累，根据研究表明，随着脯氨酸含量的增加，植物体的抗逆性也增强。脯氨酸主要是在线粒体中合成，主要分布于线粒体及 质基质中，从而提高细胞质的渗透压平衡于细胞质与液泡间的渗透压，是渗透胁迫下的叶绿体和线粒体能维持较好的水分状况，保证光合作用和呼吸作用的运行。植物体内脯氨酸含量在一定程度上反映了植物的抗逆性，抗旱性强的品种往往积累较多的脯氨酸。因此测定脯氨酸含量可以作为抗旱育种的生理指标。另外，由于脯氨酸亲水性极强，能稳定原生质胶体及组织内的代谢过程，因而能降低冰点，有防止细胞脱水的作用。植物游离脯氨酸含量的增加是植物对逆境胁迫的一种生理生化反应,是植物在逆境下的适应表现。脯氨酸具有多种生理功能,如作为细胞质渗透调节物质、稳定生物大分子结构、降低细胞酸度以及作为能量库调节细胞氧化还原势等。许多植物在受到环境胁迫,例如在干旱、盐渍、低温等胁迫条件下时,体内的脯氨酸含量会发生很大的变化。因此,通常把脯氨酸含量变化作为植物体内氨基酸代谢是否发生障碍的指标
【3】
。
（二）抗氧化酶活性
1、POD活性
OD470(3min) 实验组 对照组 2、PPO活性
实验组 对照组 OD410(3min) 活性(U.g-1FW) 0.029 3.00 25 833.33 1.024 0.967 活性值(mmol.g-1FWmin-1) 0.214 0.202 如上表所示：在干旱的条件下，POD值升高POD 也是植物抗氧化系统中重要的酶类，POD 通过催化其他底物与H2O2反应以消耗H2O2植物在受到水分胁迫及复水时，可诱导体内POD 活性上升，从而起到保护植物的作用。POD 活性在干旱胁迫下增强, 能通过增强POD 活性来抵御干旱逆境对其所造成的伤害
【4】
。多酚氧化酶( polphenol o xidase,
PPO ) 是植物体内酚类物质氧化或缩合以及木质素合成的重要酶, 提高PPO 活性可促进植株体内酚类物质和木质素的合成和累积以提高植物抗性。PPO 是一种与生长相关的酶, 刘金龙等研究表明, PPO 与仁用杏树生长发育以及抗逆性相关,是仁用杏树抗逆性生化指标，可作为栽培时选择树种的依据
【6】
【5】
。
（三）GSH测定
实验组 对照组 OD412 0.501 0.097 含量(mmol.g-1FW) 0.614 0.119 如上表所示：在干旱条件下，GSH的值较正常情况下明显增高，这是因为还原性谷胱甘肽是生物细胞中含量最丰富的非蛋白质硫醇化合物。在生物体内不同的胁迫响应途径中,利用GSH 的亲核活性来消除活性氧和重金属等对细胞的伤害。因此,在生物的氧代谢及抗逆生理中GSH 发挥着重要的作用
【7】
。小麦在干旱条件下通过提高GSH 含量
来应激环境变化。在正常供水情况下,小麦不存在干旱胁迫所带来的伤害,其体内的GSH 处于正常的代谢中,所以在整个测定过程中GSH 含量变化比较稳定（四）H2O2含量
实验组 对照组 OD410 0.531 0.194 含量(mmol.g-1FW) 31.607 11.548 【8】
。
如上表所示：实验组中的H2O2含量是对照组的3倍左右，说明在干
旱胁迫下。H2O2在干旱胁迫下所引起植物ROS最敏感的，会引起叶绿体、线粒体、过氧化物体、细胞壁及质外体中的H2O2的大量积累。在正常环境和生理条件下，活性氧和抗氧化酶系处于动态平衡之中，维持低水平的活性氧稳态，在不良环境下如干旱、低温、盐渍等，可以打破
这种平衡，其主要原因是干旱胁迫下，是光合作用CO2固定效应降低，导致更多的电子“渗漏”，是分子O2还原成活性氧O2-，增加的活性氧对细胞的伤害主要是引起膜脂过氧化，产生丙二醛，于是本来的伤害变得更加严重，同时丙二醛的生成量也是活性氧伤害的重要测试指标
【9】
。
（五）MDA和可溶性糖含量
OD450 OD532 MDA含量(mmol/L) 实验组 对照组 2.388 0.022 0.229 0.110 0.0000001406 0.00000013 0.028 0.00025 可溶性糖含量(mmol/L) 如上表所示：在干旱胁迫的作用下，MDA和可溶性糖的含量都大大增加了，由此可见干旱会使MDA和可溶性糖积累。MDA：在逆境胁迫条件下， 植物往往发生膜脂过氧化作用，MDA 是膜脂过氧化产物之一， 其含量的高低可反应逆境胁迫下植物伤害程度的大小，是膜脂过氧化程度的重要标志
【10】
。细胞膜透性和MDA 含量的变化是植物细胞膜脂过
氧化反应的表现，MDA 能与细胞内各种成分发生反应，从而引起细胞内各种膜的损伤[11]，当MDA 含量大量增加时，表明体内细胞受到严重的破坏，膜透性增加，细胞内物质外渗，细胞功能下降
【11】
。可溶
性糖：可溶性糖的含量在干旱胁迫下会加剧来抵抗干旱，能够通过渗透调节来提高作物的抗旱性。可溶性糖是植物体内的重要渗透调节物质之一，主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等，土壤水分减少时，随干旱胁迫程度增加而增加，有利于维持植物体细胞膨压，抑制由于胞内水分过度损失而造成的被动脱水
【12】
。
三、结论
通过这次试验，从结果中可以看出，植物为了适应干旱胁迫的逆境，发生了一系列的生理生化变化。通过Pro含量的增加，是植物的抗旱性加强；POD和PPO这两种重要的酶类，在干旱胁迫下POD值呈升高趋势，表明植物的抗旱性增强，PPO值下降则表明植物抗性下降，因此PPO值可以作为植物抗性的指标之一；GSH值升高，说明GSH 的亲核活性来消除活性氧和重金属等对细胞的伤害，在抗性作用中起到重要作用；H2O2在干旱胁迫下所引起植物ROS最敏感的，会引起叶绿体、线粒体、过氧化物体、细胞壁及质外体中的H2O2的大量积累，其主要原因是光合作用CO2固定效应降低，导致更多的电子“渗漏”，是分子O2还原成活性氧O2-，增加的活性氧对细胞的伤害主要是引起膜脂过氧化，从而产生MDA；而MDA较正常值相比升高，可见干旱会导致其与可溶性糖的积累。
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