第３９卷第３期 ２０１３年６月 湖南农业大学学报（自然科学版） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ） Ｖｏ１．３９ Ｎｏ．３ Ｊｕｎ．２０ｌ３ Ｄ０Ｉ：１０．３７２４／ＳＰ．Ｊ．１２３８．２０１３．００２６５ 灵芝漆酶注释基因Ｌａｃｃｌ的生物 信息学 Ｉ口， 于 分析 及其Ｃｕ２＋诱导表达 陈岳文１，２，３，康信聪 ，熊兴耀 ，刘东波 ， ， （１．湖南省作物种质资源创新与利用重点实验室，湖南 长沙４１０１２８；２．湖南农业大学同艺园林学院，湖南长沙 ４１０１２８；３．国家中医药管理局亚健康干预技术实验室， 湖南长沙４１０１２８） 摘要：为验证Ｌａｃｅ１基因的功能，揭示灵芝漆酶基因及其启动子结构与其转录表达的内在关系，预测了Ｌａｃｃｌ 的氨基酸序列结构及灵芝漆酶注释基因Ｌａｃｃｌ的上游启动子区域，研究已测序的菌株——灵芝Ｐ９在Ｃｕ 诱导 条件下漆酶基因Ｌａｃｃｌ的表达情况。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌａｓｔ分析结果表明，Ｌａｃｅ１含有３个铜氧化酶（Ｃｕ－ｏｘｉｄａｓｅ）保守结 构域，与Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｃｉｌｉａｔｕｓ漆酶ｌｃｃ３—３的相似性最高，为７ｌ％，并具有高度保守的漆酶特征序列Ｌ１一Ｌ４；亚细 胞位置和信号肽预测结果表明，Ｌａｃｃｌ含有信号肽，且为胞外分泌酶；Ｌａｃｃｌ基因上游启动子区域包含１个ＴＡＴＡ ｂｏｘ、３个金属响应元件（ＭＲＥ）、５个氮因子结合位 ￣（ＮＩＴ２）、１个压力响应元件（ＳＴＲＥ）；在１５０ ｐｍｏｌ／Ｌ Ｃｕ 的 诱导下，Ｌａｃｃｌ基因的表达在第６、８、１０和１４天分别上调了２．８、４．９、１．６和１．９倍，通过对Ｌａｃｃｌ的启动子 结构和诱导表达分析，推测灵芝漆酶注释基因Ｌａｃｃｌ的诱导表达特性与启动子区域的金属响应元件等调控位点 具有极大相关性。 关键词：灵芝；漆酶；生物信息学分析；Ｃｕ 诱导表达 文献标志码：Ａ 文章编号：１００７—１０３２（２０１３）０３—０２６５—０５ 中图分类号：￥５６７．３ １；Ｑ７８６ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｌａｃｃａｓｅ ｇｅｎｅ Ｌａｃｃｌ ｆｒｏｍ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ ａｎｄ Ｃｕ２＋ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｏ ’。’ ＣＨＥＮ Ｙｕｅ．ｗｅｎ ， ， ．ＫＡＮＧ Ｘｉｎ—ｃｏｎｇ ３ ＸＩＯＮＧ Ｘｉｎｇ—ｙａｏ ＬＩＵ Ｄｏｎｇ．，（１．Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４ １ ０ １ ２８，Ｃｈｉｎａ； ２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ，Ｈｕｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ；３．Ｓｔａｔｅ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｕｂｈｅａｌｔｈ Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ ４１０１２８，Ｃｈｉｎａ） Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｖｅｒｉｆｙ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｃｌ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｇｅｎｅ，ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｆｏｒ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ Ｌａｃｃａｓｅ，ｗｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｅ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ Ｌａｃｃ ｌ ａｎｄ ｕｐｓｔｒｅａｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｌａｃｃａｓｅ ｇｅｎｅ Ｌａｃｃｌ，ｗｈｉｌｓｔ ｓｔｕｄｉｅｄ ｔｈｅ ｐｕｔａｔｉｖｅ ｌａｃｃａｓｅ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ ｓｔｒａｉｎ Ｐ９ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｃｕ ．Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｌａｓｔ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｌａｃｃ ｌ ｈａｄ ｔｈｒｅｅ Ｃｕ－ｏｘｉｄａｓｅ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｌａｃｃ ｌ ｈａｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｗｉｔｈ ｌｃｃ３—３ ｏｆ ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｃｉｌｉａｔｕｓ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ７１％．ａｎｄ ｔｈｅ ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｌａｃｃａｓｅ ｓｉｇｎａｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌ１一Ｌ４ ｗａｓ ａｌｓｏ ｆｏｕｎｄ ｉｎ Ｌａｃｅ１．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｕｂ－ｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｉｄｅｎｔｉｉｆｃａｔｉｏｎ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｌａｃｃ ｌ ｉｓ ａｎ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ（ｓｅｃｒｅｔｅｄ）ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｔｈｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ ｕｐｓｒｔｅａｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ Ｌａｃｃｌ ｓｈｏｗｅｄ １ ＴＡＴＡ ｂｏｘ，３ ＭＲＥ（ｍｅｔａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ），５ ＮＩＴ２（ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）ａｎｄ １ ＳＴＲＥ（ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）．Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ Ｌａｃｃｌ ｗａｓ ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ２．８一ｆｏｌｄ，４．９一ｆｏｌｄ，１．６一ｆｏｌｄ ａｎｄ １．９一ｆｏｌｄ ａｔ ６‘“ｄａｙ８ ｄａｙ，１０ ｄａｙ ａｎｄ １４ “ｄａｙ ａｆｔｅｒ ，ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ １ ５０ ｐｍｏｌ／Ｌ Ｃｕ ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｉｎ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｔｏ ｔｈｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ．Ｖｉａ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｌａｃｃｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ 收稿日期：２０ｌ３＿ｏ３—ｏ４ 基金项目：国家“９７３”项目（２０ｌ２ｃＢ７２３００４）；国家农业科技成果转化项目（２０１２ＧＢ２Ｄ２ｏ０３２８） 作者简介：陈岳文（１９８８— ，男，湖南衡东人，硕士研究生，主要从事珍稀中药材种质资源保护与可持续利用研究，ｃｈｅｎ ｙｕｅｗｅｎ＠ ｆｏｘｍａｉｌ．ｃｏｍ； 通信作者，ｃｈｉｎａｓａｇａ＠１６３．ｃｏｒｎ ２６６ 湖南农业大学学报（自然科学版）ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｎｎｄｘｂ．ｃｏｍ ２０１３年６月 ａｎｄ Ｃｕ ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｔｈｅ Ｃｕ２ ｉｎｄｕｃｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｃｃｌ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｃｌｏｓｅｌｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆｓ ｓｕｃｈ ａｓ ｔｈｅ ｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｆｏｒ ｍｅｔａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｒｅｇｉｏｎ． Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ；ｌａｃｃａｓｅ；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ；Ｃｕ２ ｉｎｄｕｃｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ 漆酶（ｂｅｎｚｅｎｅｄｉｏｌ：ｏｘｙｇｅｎ ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａｓｅｓ，ＥＣ １．１０．３．２１是一类含铜多酚氧化酶，多分布于植物Ｌ１Ｊ 和真菌 中，在部分细 和节肢动物中也有分布［４】ｃ 目前，对漆酶的研究主要集中在担子菌亚门的白腐 真菌【５】。漆酶在孢子分裂、子实体分化、色素生成、 抗胁迫、木质素降解［６】过程中扮演着重要角色。漆 酶具有广泛的底物专一性，能够直接催化氧化邻一 苯二酚、对一苯二酚、氨基酚、多酚、多胺和二芳 胺等难降解化合物［ ，在染料脱色、纸浆漂白、土 壤修复、生物传感器和生物质能源 １等方面应用广 泛。漆酶的合成与分泌受到营养水平（ｃ／Ｎ）、培养条 件、生长时期以及所添加诱导物（芳香类物质、金属 离子等）的影响，这些影响因素大部分都作用在漆酶 的转录水平，这可能与漆酶结构及其基因上游启动 子区域相关的顺式作用相关 Ｊ。 灵芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）属于真菌门、担子菌纲、 多孑Ｌ菌科、灵芝属，其食用、药用价值一直都是关注的 热点，人工栽培技术也相当成熟。目前，对灵芝分解、 利用木质素的酶系统的研究很少。国家中医药管理局亚 健康干预技术实验室于２０１２年５月发布的灵芝全基因 组精细图谱是世界上首个公开发表的兼性腐生真菌基 因组图［１。１，它不仅提出了灵芝重要药效成分——灵芝 三萜的完整代 合成途径，而且揭示了灵芝在木质素纤 维素降解方面的巨大潜力【１…。在灵芝全基因组中，发 掘出了真菌木质素氧化酶（ｆｕｎｇａｌ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｌｉｇｎｉｎ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｅｎｚｙｍｅｓ，ＦＯＬｙｍｅｓ）家族中的１６个漆酶基因， 与其他担子菌比较，灵芝漆酶基因拷贝数仅次于灰盖鬼 伞菌（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ），提示灵芝具有很强的木质素 降解能力。根据灵芝基因组测序结果，Ｌａｃｃｌ是由漆酶 注释基因Ｌａｃｃｌ所推断的氨基酸序列。笔者对Ｌａｃｃｌ 的氨基酸序列和漆酶注释基因Ｌａｃｃｌ上游启动子区域 进行分析预测，研究已测序的菌株一灵芝Ｐ９在Ｃｕ 诱导条件下漆酶基因Ｌａｃｃｌ的表达情况，旨在为进一步 探索漆酶基因的调控机制提供依据，为灵芝漆酶基因的 功能基因组分析打下基础。 １材料与方法 １．１ 材料 １．１．１供试菌株及主要生化试剂 灵芝（Ｇａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ）Ｐ９菌株，由国家中医药 管理局亚健康干预技术实验室保存。 反转录试剂盒（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ）和荧光 定量ＰＣＲ所需ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅ购 自Ｔａｋａｒａ；荧光定量ＰＣＲ引物由深圳华大基因科技有 限公司合成。 １．１．２培养基 菌种生长培养基：ＰＤＡ培养基（马铃薯２００ ｇ／Ｌ，葡萄糖２０ ｇ／Ｌ，琼脂粉１５ ｇ／Ｌ）。 漆酶产酶培养基：秸秆粉（过０．３ ｌｎｎｌ孑Ｌ径筛）３０ ｇ／Ｌ，葡萄糖１０ ｇ／Ｌ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ０．００５ ｇ／Ｌ，基础培 养基１００ｍＬ／Ｌ。 基础培养基：ＫＨ２ＰＯ４ ０．２ ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４＂７Ｈ２Ｏ ０．０５ Ｌ，ＣａＣ１２０．０１ ｇ／Ｌ，Ｔｏｗｅｅｎ－８０ ５ ｇ／Ｌ，Ｖ—Ｂ１ ０．１ ｇ／Ｌ，微量元素培养基１ ｍＬ／Ｌ。 微量元素培养基：ＭｎＳＯ４ ０．５ ｇ／Ｌ，ＦｅＳＯ４＂７Ｈ２Ｏ ０．１ ｇ／Ｌ，ＣａＣＩ２ ０．１ ｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ４‘７Ｈ２０ ０．１ ｇ／Ｌ， ＣｕＳＯ４‘５Ｈ２０ ０．０１ ｇ／Ｌ，Ａ１Ｋ（ＳＯ４）２‘１２Ｈ２０ ０．０１ ｇ／Ｌ． Ｈ３ＢＯ３ ０．０１ ｇ／Ｌ。ＮａｚＭｏＯ４‘２Ｈ２０ ０．０１ ｇ／Ｌ。 １．２方法 １．２．１ Ｌａｃｃｌ氨基酸结构分析 通过ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ１ 对Ｌａｃｃｌ进行Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｌａｓｔ，与ＮＣＢＩ数据库中的氨 基酸序列进行同源性比对；应用ＤＮＡｍａｎ软件对 Ｌａｃｃｌ氨基酸序列与糙皮侧耳（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）漆 ￣（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＡＲ２ １ ０９４）、灰盖￣（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）漆酶（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＢＰ８１８３７）、云芝 （Ｔｒａｍｅｔｅｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）漆酶（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＣＡＡ ７７０１５）、黄孢原毛平革菌（Ｐｈａｎｅｒｏ—ｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙｓｏｓ— ｐｏｒｉｕｍ）漆酶（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ＡＡＯ４２６０９）、裂褶菌 （Ｓｃｈｉｚｏｐｈ￣ ｌｌｕｍ ｃｏｍｍｕｎｅ）漆酶（ＧｅｅＢａｎｋ登录号ＢＡＡ 第３９卷第３期 陈岳文等灵芝漆酶注释基因Ｌａｃｃｌ的生物信息学分析及其Ｃｕ 诱导表达 ２６７ ３１２１７１、双色蜡蘑（Ｌａｃｃａｒｉａ ｂｉｃｏｌｏｒ）漆酶（Ｇｅｒ￣３ａｎｋ 登录号ＡＣＮ４９０９６）、球型马拉色菌（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ ｇｌｏｂｏｓａ） Ｌａｃｃｌ－Ｆ：５＇－ＣＣＡＴＴＣＧＣＴＣＡＣＣＧＴＣＡＴＣ－３ ； Ｌａｃｃｌ—Ｒ：５＇－ＣＣＴＴＴＧＣＣＴＴＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＣ一３ ； 漆酶（ＧｅｎＢａｎｋ登录号ｘＰ ００１ ７２８５９７）等７个漆酶氨 基酸进行序列比对，并构建系统发育树。 应用ＳｉｇｎａｌＰ ４．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ ＳｉｇｎａｌＰ／）和Ｐｒｏｔｃｏｍｐ ９．０（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｘ１．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／） 对Ｌａｃｃｌ的氨基酸序列进行信号肽和亚细胞位置预测。 １．２．２ Ｌａｃｃｌ基因上游启动子区域预测 选取Ｌａｃｃｌ基因上游２ ０００ ｂｐ区域，应用 Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｌｉｎｕｘ １．ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ．ｃｏｍ／）和ＴＥＳＳ ｆｈｔｔｐ：／／ ｗ１Ⅳ１Ⅳ．ｃｂｉｌ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／）数据库对启动子区域转录调控 元件进行预测。 １．２．３菌株的培养 将灵芝Ｐ９菌种接种于ＰＤＡ平板，于２５℃培养 ７ ｄ后４℃保存。取菌龄为７ ｄ的菌块（直径约６ ＩＩｌＩＩ１） 接种于装有１ ００ ｍＬ液体产酶培养基的２５０ ｍＬ锥形 瓶中，２５℃，１５０ ｒ／ｍｉｎ，避光培养。培养７２ ｈ后， 将ＣｕＳＯ 溶液加入到培养基中，至Ｃｕ２＿终浓度为１５０ ￣ｍｏｌ／Ｌ［¨］，并设置培养基中未加Ｃｕ２ 的阴性对照组。 １．２．４粗酶液和菌丝的获得 收集不同培养时期（第４、６、８、１０、１２、１４ 天）的灵芝菌球，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，弃上清 液，菌球经液氮速冻后一８０℃保存，备用。 １．２．５ ＲＮＡ的制备和ｅＤＮＡ反转录 灵芝总ＲＮＡ提取：取不同时期的灵芝菌球样 本，液氮速冻研磨成粉，采用改良ＣＴＡＢ法［１ 】提取。 ｌ％琼脂糖凝胶电泳验证总ＲＮＡ完整ｌ生，用紫外分 光光度法（ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ一１ ０００）Ｏ￣ｌＪ定所提ＲＮＡ的纯 度和浓度。 取１ ｇｇ灵芝总ＲＮＡ样本，用反转录试剂盒 ｆＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ，Ｔａｋａｒａ）进行ＲＮＡ的反 转录，合成第一链ｃＤＮＡ（根据试剂盒说明，总ＲＮＡ 样本中的基因组ＤＮＡ污染会在ｃＤＮＡ链合成前去 除），用紫外吸收法测定ｃＤＮＡ浓度。 １．２．６实时荧光定量ＰＣＲ（ＲＴ—ｑＰＣＲ） 运用Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５．０软件对Ｌａｃｃｌ基因和内 参基因ＧＡＰＤＨ（甘油醛一３一磷酸脱氢酶基因）设计特 异性引物，引物由深圳华大基因科技有限公司合成。 ＧＡＰＤＨ－５＇－Ｆ：ＣＧＣＴＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＧＴＣ ＡＡ一３ ：５＇－ＧＡＰＤＨ－Ｒ：ＧＴＡＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＴＣＡＣ ＡＧＡ－３ 。 反应体系（１０ Ｌ）：５ ｇＬ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｔａｑ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘｔｕｒｅ，上、下游引物（１ ０ ｇｍｏｌ／Ｌ）各０．４ ｇＬ，０．８ ｇＬ ｃＤＮＡ模板（４ｏｏ ｎｇ／ｇＬ）和３．４ ｇＬ ｄｄＨ２０。 所有检测样品设置３个重复，并设置样本阴性对照 （ＮＴＣ）。ＲＴ－ｑＰＣＲ于Ｂｉｏ－－Ｒａｄ ＣＦＸ９６ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ上进行。反应程序：９５℃预变Ｉ生３０ Ｓ； ９５℃变性５ Ｓ，６０℃退火３０ Ｓ，共４０个循环。 １．２．７标准曲线的制定 根据不同的ｃＤＮＡ浓度，分别采用不同的梯度 稀释倍数（１０倍或５倍）制作Ｌａｃｃｌ和ＧＡＰＤＨ基因 的标准曲线，计算扩增效率。 １．２．８数据分析 采用文献［１３］方法对Ｉ ｑＰＣＲ的数据进行处 理，计算Ｌａｃｃｌ基因的相对表达量。 ２结果与分析 ２．１ Ｌａｃｃｌ氨基酸结构预测分析结果 漆酶注释基因Ｌａｃｃｌ全长１ ５３９ ｂｐ，位于灵芝 基因组图谱ｓｃａｆｆｏｌｄ １７６的８１８６９：８３８６２位（Ｇｅｎｂａｎｋ Ｎｏ．ＪＨ６６０８２２），由Ｌａｃｃｌ基因所推断的Ｌａｃｃｌ含有 ５ ｌ２个氨基酸。ＳｉｇｎａｌＰ ４．０结果显示，Ｌａｃｃｌ含有信 号肽的可能性为９０．５％，剪切位点在２４和２５个氨 基酸之间的最大可能性为７９．４％。由Ｐｒｏｔｃｏｍｐ９．０ 预测结果可知：Ｌａｃｃ ｌ在细胞外的可能性为９３％； 在内质网的可能性为３％；在线粒体的可能性为３％； 在高尔基体的可能性为１％，由此可以推测Ｌａｃｃｌ 为胞外分泌蛋白。 Ｂｌａｓｔｐ结果显示，Ｌａｃｃｌ氨基酸序列含有３个 铜氧化酶保守结构域，ＧｅｎＢａｎｋ登录号（ｐｆａｍ０７７３２、 ｐｆａｍ００３９４和ｐ￣ｍ０７７３ １），与Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ ｃｉｌｉａｔｕｓ的 漆酶ＬＣＣ３—３具有７１％的最大相似性。同源进化分 析结果如图１所示。灵芝漆酶Ｌａｃｃ１与Ｔ．ｖｅｒ漆酶 第３９卷第３期 陈岳文等灵芝漆酶注释基因Ｌａｃｃｌ的生物信息学分析及其ｃｕ 诱导表达 ２６９ 列中发现３个铜氧化酶的保守结构域（ＧｅｎＢａｎｋ登 录号ｐｆａｍ０７７３２、ｐｆａｍ００３９４和ｐｆａｍ０７７３１）。在这 ３个结构域中通常结合４个铜原子，２个组氨酸（Ｈｉｓ） 和１个半胱氨酸（Ｃｙｓ）作为铜配体位于Ｎ端区域，８ 个组氨酸作为铜原子结合位点分布于Ｃ端Ｌ８Ｊ，这１ ０ 个组氨酸和１个半胱氨酸及其周围的氨基酸残基都 非常保守，因此，Ｌａｃｃｌ属于多铜氧化酶（ＭＣＯ）中 的一类。通过Ｌａｃｃｌ氨基酸序列与其他白腐菌漆酶 的氨基酸序列比对和分析，发现Ｌａｃｃ ｌ含有非常保 守的漆酶特征序列Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４（Ｌ１：Ｈ—ｗ—Ｈ．Ｇ＿ Ｘ９一Ｄ— ；一Ｘ５－ＱＣＰＩ：Ｌ２：Ｇ—Ｔ 》（一Ｗ—Ｙ＿Ｈ＿Ｓ—Ｈ—Ｘ３一 Ｑ—Ｙ＿Ｃ—Ｘ＿Ｄ＿Ｇ＿Ｌ—ｘ—Ｇ＿Ｘ一（ＦＬＩＭ）；Ｌ３：Ｈ＿Ｐ—Ｘ＿ Ｌ—Ｈ—Ｇ—Ｈ；Ｌ４：Ｇ－（ＰＡ）－ｗ—）（一（ＬＦＶ）一ＨＣＨＩ－ＤＡＥ— Ｘ＿Ｈ—ｘ３—Ｇ一（ＬＭＦ）－Ｘ３一（ＬＦＭ１ ）。此序列可以将 Ｌａｃｃｌ与其他的多铜氧化酶，如抗坏血酸氧化酶、 血浆铜蓝蛋白区分开来，通常用于漆酶的鉴定Ｌ１引。 笔者在对Ｌａｃｃｌ基因的上游启动子区域进行分 析过程中，检索出多个顺式作用元件，如ＭＲＥ（核 心序列为５＇－ＴＧＣＲＣＮＣ一３ １ 、ＮＩＴ２（核心序列为 ５＇－ＴＡＴＣＴ一３ 或５ｒ＿ＧＡＴＡ一３ ） Ｊ和ＳＴＲＥ（核心序列为 ５＇－ＣＣＣＴ－３ ）ｌ１ ６ｌ等。ｃｕ２＋诱导灵芝漆酶注释基因 Ｌａｃｃｌ转录过程中，Ｌａｃｅ上游启动子中的ＭＲＥ很 有可能与Ｃｕ 应答，从而参与调节基因的表达。 Ｐｉｓｃｉｔｅｌｌｉ等［ ］研究认为，Ｃｕ２＋能诱导漆酶及漆酶基因 的转录，其中Ｃｕ２＋对漆酶基因转录水平的影响与其 启动子区域内的金属响应元件等顺式作用元件的 分布有着紧密联系，启动子区域中的金属响应位点 能够与金属离子应答，从而调节基因转录，这种模 式在真菌中普遍存在。除此之外，漆酶基因Ｌａｃｃｌ 启动子区域出现了ＳＴＲＥ和ＮＩＴ２，表明该基因很有 可能受到外界环境胁迫及受培养基中氮源调控 ，１圳。 笔者对灵芝漆酶基因Ｌａｃｃｌ的启动子结构及 Ｌａｃｃｌ的Ｃｕ 诱导表达情况进行分析，明确了启动 子区域的ＭＲＥ等调控位点和ｃｕｚ十诱导Ｌａｃｃｌ基因 表达间的关系，这为后续利用定点突变等手段阐明 Ｌａｃｃｌ基因与启动子区域调控位点的关系，以及通 过异源表达验证Ｌａｃｃｌ基因功能提供了依据，为发 掘木质素降解高效酶系打下了基础。 参考文献： ［１】 Ｍａｙｅｒ Ａ Ｍ．Ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ ｏｘｉｄａｓｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ－ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ［Ｊ］．Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８７，２６：１１ ２０． ［２］ Ｈａｔａｋｋａ Ａ．Ｌｉｇｎｉｎ—ｍｏｄｉｉｒｃｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅｓ ｆｒｏｍ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｗｈｉｔｅ—ｒｏｔ ｆｕｎｇｉ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｌｅ ｉｎ ｌｉｇｎｉｎ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｊ］． ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９４，１３：１２５—１３５． ［３］ Ｃａｒｄｅｎａｓ Ｗ，Ｄａｎｋｅｒｔ Ｊ Ｒ．Ｃｒｅｓｏｌａｓｅ，ｃａｔｅｃｈｏｌａｓｅ ａｎｄ ｌａｃｃａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｈａｅｍｏｃｙｔｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｄ ｓｗａｍｐ ｃｒａｙｆｉｓｈ［Ｊ】．Ｆｉｓｈ Ｓｈｅｌｌｉｆｓｈ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０００，１ ０：３３ ６． ［４］ Ｋｒａｍｅｒ Ｋ Ｊ，Ｋａｎｏｓｔ Ｍ Ｒ，Ｈｏｐｋｉｎｓ Ｔ Ｌ，ｅｔ ａ１．Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｔｅｃｈｏｌｓ ｗｉｔｈ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｉｎｓｅｃｔ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ［Ｊ］．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，２００１，５７：３８５—３９２． ［５］ Ｓａｐａ￣ａｔ Ｍ，Ｂａｌａｔｔｉ ＰＡ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ Ｍ Ｊ，ｅｔ ａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｃｏｒｉｏｌｏｐｓｉｓ ｒｉｇｉｄａ ＬＰＳＣ Ｎｏ．２３２［Ｊ］．Ｆｕｎｇａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０， １ １４（１ １／１２）：９９９—１００６． ［６］ Ｋｉｌａｒｕ Ｓ，Ｈｏｅｇｇｅｒ Ｐ Ｊ，Ｋｆｉｅｓ Ｕ．Ｔｈｅ ｌａｃｃａｓｅ ｍｕｌｔｉ—ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ ｃｉｎｅｍａ ｈａｓ ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｍｅｍｂｅｒｓ ｔｈａｔ ｄｉｖｉｄｅ ｉｎｔｏ ｔｗｏ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｓｕｂｆａｍｉｌｉｅｓ［Ｊ］． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２００６，５０（１）：４５￣５０． ［７】 Ｇｉａｒｄｉｎａ Ｐ，Ｆａｒａｃｏ Ｖ，Ｐｅｚｚｅｌｌａ Ｃ，ｅｔ ａ１．Ｌａｃｃａｓｅｓ：Ａ ｎｅｖｅｒ－ｅｎｄｉｎｇ ｓｔｏｒｙ［Ｊ］．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２００９，６７（３）：３６９－３８５． ［８】 Ｕｒｓｕｌａ Ｋｎｅｓ．Ｍａｒｔｉｎ Ｒｔｉｈ１．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｕｌｔｉ—ｃｏｐｐｅｒ ｏｘｉｄａｓｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｉｅｓ ｉｎ ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ—ｗｈａｔ ｆｏｒ？［Ｊ】．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１ １，１２（２）：７２－９４． ［９］ Ｐｉｓｃｉｔｅｌｌｉ Ａ，Ｇｉａｒｄｉｎａ Ｐ，Ｌｅｔｔｅｒａ Ｖ，ｅｔ ａ１．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅｓ ｉｎ ｆｕｎｇｉ［Ｊ］．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２０１１（１２）：１０４－１１２． ［１０］ Ｌｉｕ Ｄ，Ｇｏｎｇ Ｊ，Ｄａｉ Ｗ，ｅｔ ａ１．Ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ ｏｆＧａｎｏｄｅｒｍａ ｌｕｃｉｄｕｍ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｎｓｉｇｈｔｓ ｉｎｔｏ ｔｒｉｔｅｒｐｅｎｅｓｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｗｏｏｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＰＬｏＳ ＯＮＥ，２０１２，７（５）： ｅ３６１４６． Ｐｅｚｚｅｌｌａ Ｃ，Ｌｅｔｔｅｒａ Ｖ，Ｐｉｓｃｉｔｅｌｌｉ Ａ，ｅｔ ａ１．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ ｌａｃｃａｓｅ ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０ １ ２，９７（２）：７０５—７ １ ７． ［１２］ 康信聪，刘东波，夏志兰，等．北冬虫夏草ＤＮＡ提取 方法的比较［Ｊ］．湖南农业大学学报：自然科学版，２０１１， ３７（２１：１４７—１４９． ［１３】 Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ Ｔ Ｄ，Ｌｉｖａｋ Ｋ Ｊ．Ａｎａｌｙｚｉｎｇ ｒｅａｌ—ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄａｔａ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ＣＴ ｍｅｔｈｏｄ［Ｊ】．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， ２００８，３（６）：１１０１—１１０８． ［１４］ 钞亚鹏，钱世钧．真菌漆酶分子生物学研究进展［Ｊ］．生 物工程进展，２００１，２１（５）：２３—２７． ［１５］ Ｋｕｍａｒ Ｓ Ｖ，Ｐｈａｌｅ Ｐ Ｓ，Ｄｕｒａｎｉ Ｓ，ｅｔ ａ１．Ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｕｎｇａｌ ｌａｃｃａｓｅ ｆａｍｉｌｙ［Ｊ】．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００３， ８３（４）：３８６－３９４． ［１６］ Ｓｏｄｅｎ Ｄ Ｍ，Ｄｏｂｓｏｎ Ａ Ｄ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｃｃａｓｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｓａｊｏｒｃａｊｕ［Ｊ］． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１，１４７（７）：１７５５—１７６３． 责任编辑：罗维 英文编辑：罗维