丙型肝炎病毒基因疫苗研究进展

丙型肝炎病毒(HCV)是输血后肝炎的主要病原体，HCV急性感染后约50％-70%以上患者发展为慢性感染，其中部分病人可发展为肝硬化，甚至肝癌。迄今为止，对HCv慢性感染尚无高效特异性治疗方法，对IFN-α的治疗应答率只有15％~25％[1]。因此，寻求一种预防和治疗HCV感染的方法迫在眉睫。

基因疫苗又称为核酸疫苗或DNA疫苗，它是由病原体抗原的编码基因和作为真核细胞表达载体的质粒所组成。这种DNA既是载体又能在真核细胞中表达抗原，刺激肌体产生特异而有效的免疫应答，可有效预防病毒、细菌和寄生虫等所引起的疾病。DNA疫苗由于具有可诱发细胞免疫和体液免疫应答、能制备抗多价疫苗、兼有预防和治疗作用等优点，且与传统疫苗相比，DNA疫苗在细胞内表达的抗原具有天然构象，免疫原性良好，容易制备和运输，所以自上世纪90年代初问世以来，已在多种疾病的防治研究中显示出巨大的潜力[2-6]。HCV DNA疫苗是近年发展起来的新型疫苗之一，它是将HCVRNA上的某一特定片段克隆入适当的表达载体中再接种到体内，使目的基因得以表达，诱导机体产生特异的体液免疫和细胞免疫，以期达到预防和清除HCV感染的目的。本文就HCVDNA疫苗的类型、免疫效果的影响因素、作用机制及安全性等方面的研究进展作一综述。

l 不同类型HCV DNA疫苗的构建

1．1 HCV核心区DNA疫苗的构建

对来自不同基因型的HCV分析发现，其核心区(C区)基因片段高度保守，整个序列全长573核苷酸，编码含191个氨基酸的核心蛋白。Tokushige等[7]将全长C区片段克隆在包含有RSV启动子和CMV增强子的表达质粒中，构建pHCV2—2质粒，同时构建一个包括HCV 5’NCR和C区全部序列的pHCV4—2质粒，用磷酸钙沉淀法分别转染HuH—7细胞、RD细胞和G8细胞系。Western blot分析发现，3个细胞系中均表达21kd的核心蛋白。且Phv2-2质粒转染细胞的蛋白表达量明显高于pHCV4-2。单克隆抗体检测HCV核心蛋白为非分泌蛋白。用构建好的质粒肌肉注射BALB／C小鼠，小鼠对HCV C区蛋白体液免疫反应性较低，可能和C区蛋白非分泌有关。

为了评价小鼠体内CTL活性，Tokushige还建立了表达HCV核心蛋白的同基因SP2/0骨髓瘤细胞模型。和接种pHCV4—2质粒的小鼠相比，pHCV2—2质粒免疫的小鼠存活率明显增加、肿瘤的重量也明显降低，这表明pHCV2—2能引起较强的免疫应答。pHCV2—2质粒比pHCV4—2质粒的免疫效果为好，可能与Phcv2—2在细胞内表达的核心蛋白能诱导细胞免疫活性有关。

Major 等构建了表达HCV C区核蛋白前58个氨基酸的质粒 DNA—PC2N， 免疫Balb／c小鼠(下同)，在14同内均未出现抗体反应。而用该段基因与HBV的S基因，或与前S2基因构建嵌合DNA质粒，用同样方法免疫小鼠，结果均产生抗体反应，且可持续18周[8]。Lagging等用编码整个核壳蛋白(aa1-191)基因构建成DNA疫苗肌肉注射小鼠，均能引起血清抗体、脾细胞对合成肽C7—A10的增殖反应，且能诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的杀伤活性[9]。

Ceissler等认为，HCV C区核壳蛋白能诱发机体产生广泛的体液和细胞免疫，这对清除HCV感染非常重要。在先前研究基础上，用HCV C区和HBV的前S1、前S2、S基因构建了9种不同重组体，转染不同细胞系，然后再免疫小鼠。结果显示，HCV C区蛋白及不同嵌合蛋白均可在转染细胞中表达，并可激发和增强小鼠CD4+T和CD8+T对HBV和HCV融合蛋白反应，免疫强度与CD4+T淋巴细胞产生的Th1样细胞因子水乎有关[10]。

1．2 HCV包膜区DNA疫苗的构建

HCV包膜区(E区)全长574—2427nt；分E1区(574一1149nt)和E2(1150一2427nt)，分别编码El、E2糖蛋白，其在病毒结合靶细胞方面起重要作用。Rosa[11]通过NOB(neutralization of binding)定量试验证实，HCV E2上至少存在可编码两种中和抗原从的基因片段，其一是位于E2区N端的高变区(high varible region，HRV)，另一片段独立于HRV以外，编码抗原能引起不同型HCV的交叉免疫反应。 Lee等[12]用编码192—364、384—719氨基酸残基的E1区和E2片段分别和HSV—I编码糖蛋白D的基因片段连接后克隆到pTV2质粒中，构建PTv2—SElt和pTV2-SE2t疫苗。胫前肌注射Buffalo小鼠，在小鼠体内分别产生抗体和淋巴细胞增殖反应，且pTV2-SE2t疫苗的免疫原性高于pTV2—SElt。为研究HCVE2片段不同功能区的免疫原性，Nakano等[13]将HCV E2片段分成五个功能区，即E2A(1150-1332nt)、E2B(1333—1512nt)、E2C(1513—1668nt)、E2D(1669一1827nt)、E2E(1828—2022nt)、将其分别和编码HBV表面抗原的基因片段融合，以CMV为启动子构建PS2．E2A一2E五个DNA疫苗。基因枪皮下注射BALB／C小鼠，结果发现HCV E2区有三个限制性免疫原性功能区，它们分别是E2A(aa 384—443)、E2C(aa504—554)和E2E(aa 609—674)。用构建的重组体以不同方式免疫小鼠，结果显示，用基因枪从皮内注射（i.e）比从肌肉注射（i.m）产生抗体滴度高100倍，这可能与皮内有更多的朗罕细胞，能更有效的将表达的抗原递呈给免疫系统有关。此外，E2区抗体能与不同HCV亚型E1、E2结合，显示E2区的抗体可能有交叉中和作用。而Howard[14]在研究中指出在HCV E2区编码的aa 581—591和aa590—603是两个能和HCV人抗体反应的重要抗原表位。同年，Tedeschi[15]将E2(1432—2451nt)克隆入Pdr2质粒，构建pDR2疫苗，接种BALB／C小鼠也证实了小鼠能产生对HCV有重要中和作用的特异性抗体。 Foomillier等[15]以HCV基因型E2区不同基因片段构建了3种不同重组体，用i.m或i.m加i.e等不同途径免疫小鼠，抗体阳性率在60%-100%之间，其中以i.m加i.e方法效果最好，i.e方法其次，主要是IgG2a，IgG2b，没有测出IgG1，显示出Th1样反应，鼠脾细胞还可分泌IFN-γ，但未检出IL-4。随着对HCV E区DNA疫苗研究的深入[16]，提示其可能是未来HCV DNA疫苗研究的热点之一。 1.3 HCV 结构区DNA疫苗的构建

1997年Saito等[17]将编码结构区（C+E1+E2）基因片段（341~2449nt）克隆入含CMV启动子的pRc载体中，构建HCV结构区DNA疫苗，通过真核细胞体外表达和免疫小鼠研究证实，不仅能在人类293、BALB/3T3、COS-1中表达C、E1、E2蛋白，而且还能诱导BALB/C小鼠产生抗体和特异性CTL的活性。Inchauspe等[18-19]用HCV C+E2序列构建的质粒DNA疫苗免疫小鼠能诱导特异性的CTL活性、抗-C和抗-E2抗体的免疫应答和Th1为主的增殖反应。 Duenas-Carrers等[20-21] 用HCV C+E2序列构建的质粒plDKE2 DNA疫苗免疫小鼠和猴也能诱导较强的特异性的CTL活性、抗-C和抗-E2抗体的免疫应答反应。

1.4 HCV非结构区（NS区）DNA疫苗的构建

1996年，Kurokohchi等[22]证实在HCV NS3存在一个CTL表位，其最小单位由10肽组成，推测其可作为HCV DNA疫苗构建的有效组分。但近来对HCV NS区疫苗构建的报道研究较少，可能与NS区编码的非结构蛋白抗原性及诱导宿主产生特异性免疫应答反应较弱有关。

2 HCV DNA免疫效应的影响因素 2．1 细胞因子

细胞因子可通过不同的作用环节调节和增强HCVDNA疫苗的免疫效应而发挥佐剂作用。Ceissler等[10]发现单独用编码HCV C区基因构建的pHCV2—2疫苗免疫动物时，虽然机体

产生有效的CTL反应，但体液应答和Th细胞的增殖作用较弱。当用编码GM—CSF、IL-2的质粒和pHCV2—2联合免疫时，抗HCV核心蛋白的血清转化率从单独pHCV2—2免疫时的40％提高至80％。进一步研究指出，联合接种IL-2和GM—CSF质粒能增进小鼠既CD+4炎性细胞的增殖和CD+8抗HCV核心蛋白CTL的活性；而仅联合接种IL-4质粒，能促使Th细胞向Th0亚型的分化，且能抑制HCV核心蛋白特异性CTL活性。Lee等[3]用编码HCV El或E2蛋白的基因和编码GM—CSF基因融合或非融合表达质粒免疫小鼠后发现，融合表达DNA疫苗的免疫效果比两个独立表达的DNA疫苗免疫效果好，这可能与融合表达后GM—CSF的生物学活性改变有关。 2．2核苷酸的序列

HCV DNA疫苗的构建大都台有氨基糖甙类抗生素(如氨苄青霉素)抗性基因，这主要是因为氨苄青霉素抗性基因中存在着免疫刺激元件(ISS)。研究发现，ISS实际上是段含有CpG两侧分别为两个嘌呤和两个嘧啶的特定核昔酸序列，如5’-GACG -TC-3’、5’-AGCGCT—3’、5’—AACGTT—3’。已证明ISS能诱导NK细胞分泌IFN—Y、Thl分化增殖、APC上协同刺激因子的表达和在不同细胞因子环境下B细胞独特性的转换[23]。Sato等[24]发现，用卡那霉素抗性基因构建的DNA疫苗免疫原性较弱。上述结果表明，质粒DNA上的不同抗性基因在DNA免疫中也发挥了佐剂作用。 2．3免疫途径和免疫方式

免疫接种时，由于免疫途径和免疫方式不同，可导致机体产生不同类型、不同强度的免疫应答。Nakano等[13]用编码HCV E2蛋白基因构建PCI E2t疫苗，用基因枪分别皮内和服内注射BALB／C小鼠，结果皮内注射抗体效价是肌内注射的100倍，且有较高的血清转换率，这可能与表皮内含有大量的Langerhans细胞，其在抗原递呈和免疫应答中起重要的作用有关。Feltquate [25]的研究表明，不同的免疫方式会影响免疫应答的类型。用编码同一抗原的基因疫苗以DNA盐水注射和基因枪两种方式免疫接种，结果盐水注射DNA疫苗显示以诱生Thl为主的增殖反应，产生抗体为IgG2a型；而基因枪接种以诱生Th2为主的增殖反应，抗体主要为IgGl型。 2．4 其它因素 有学者报道，构建不同编码基因融合DNA疫苗能增强疫苗的免疫效果。Inchauspe在编码HCV核心蛋白1—58位氨基酸的DNA序列3’端串联HBsAg基因构建的表达质粒，其表达产物为分泌型融合蛋白，诱生抗体应答效力明显提高[26]。此外，在构建疫苗时，不同的启动子类型、免疫不同遗传背景的小鼠，都可影响免疫效果。 3 HCV DNA疫苗的作用机制 3．1 不同免疫方式免疫机制的探讨

目前，DNA疫苗接种方式主要有两种，一是盐水注射，另一是基因枪接种，其产生的免疫应答类型亦不同。盐水注射DNA疫苗时：①皮肤或肌肉的细胞外组织间隙中存在大量的DNA质粒，由于质粒中多含有未甲基化的CpG回文结构，可诱导NK细胞、T细胞增殖产生Thl型细胞因子，如IL-12、IFN—Y等[25]；②组织细胞中的APC细胞(如巨噬细胞)摄人少量DNA质粒，可以激活核因子NF—κB诱导IL-2、IL-l2等细胞因子的表达[27]；③组织细胞(如角质细胞、肌细胞)中摄人的DNA质粒在其细胞浆中表达，并经其内蛋白酶体降解后和内质网中合成的MHC-I类分子结合，递呈至CD+8T细胞，同时间接激活Thl亚群，诱生Thl型细胞因子和抗体IgG2a产生[28-29]。而基因枪接种时，由于能将外源基因直接注人靶细胞内，质粒在靶细胞的内质网（EB）内膜上大量表达形成自噬体，后者和细胞浆中的胞内体(endosome)或溶酶体(1ysosome)融合，通过MHC—Ⅱ类途径激活CD+4T细胞，诱导IL-4、IL—10等细胞因子和IgGl、IgE的产生。Chen等[30]通过构建pCMV980质粒(含编码HCVl一980 aa的基因片段)体外转染EB病毒转化的B—LCLs(B Lymphoblastiod Cell

Lines)证实，B—LCLs表达的内源性抗原是以MHC—II类途径诱导CD+4T细胞的活化，且活化过程需要B7/BB1的参与。

3. 2 免疫位点处参与免疫应答各细胞功能的探讨

研究发现，在DNA疫苗的接种位点，不同的细胞行使不同的功能。K1inman等[31]把接种位点细胞分为二类：一类是可快速迁移的细胞(如一些髓源性的APC细胞)，另一类是不可迁移的组织细胞。它们在免疫应答时：①可快速移动的细胞(如DC细胞)在初次应答中起重要作用，Condon[32]也证实免疫接种位点处被转染的DC细胞在24h内可从皮肤移至引流区淋巴结；②机体免疫应答的强弱和非迁移的表达抗原的组织细胞关系密切；③可迁移细胞负责机体的免疫记忆。

4. HCV DNA疫苗的安全性及前景

目前．从国内外学者在HCV DNA疫苗的构建、免疫效应及安全性方面做的大量研究来看，虽未发现因使用DNA疫苗而引发肿瘤和自身免疫功能紊乱的报道，但也有若干问题值得关注：①HCV DNA疫苗引起的机体免疫应答能否起到预防和清除HCV感染作用；②鉴于细胞免疫应答可介导组织病理性损伤，HCV DNA疫苗诱发的CTL反应能否引起肝脏的病理学变化[33]；③由于免疫对抗作用的限制．尚不能构建来自多个不同HCV基因型的融合DNA疫苗[34]；④HCV DNA疫苗能否引起机体产生免疫耐受；⑤由于目前的研究大多仅局限于小鼠，其作用机制和灵长类动物之间还有很大的差异等等 5. 问题与对策

综上所述，HCV El、E2蛋白疫苗免疫黑猩猩后，在抗体达到高峰时，可预防同源性HCV感染，但能否预防异源性HCV感染以及当抗体滴度下降时是否还能预防同源性感染这些问题尚待研究。抗E2抗体，特别是抗HVRl抗体(NOB)具有中和HCV对靶细胞的结合作用，预示着有中和同源性HCV感染作用，但这一中和抗体具有高度特异性，对突变的HCV及HCV准种株没有中和作用，而且蛋白类疫苗诱导产生的抗体能维持多久，也不甚清楚[35]。 以E2区为靶抗原的DNA疫苗构建物可有效地诱导抗体反应，诱导CTL反应的能力较弱；以C区为靶抗原的DNA疫苗诱导CTL反应的能力较强，激发抗体反应能力却不如还E2靶抗原。C区基因与HBV包膜区基因结合疫苗，以及与表达Thl样细胞因子(IL-2、IFN-γ等)基因结合构建的嵌合DNA疫苗免疫小鼠，既可产生高滴度的抗体反应，又可诱导明显的脾细胞对HCV抗原增殖反应和CTL杀伤活性[36]，但这些研究结果有些还不能得出满意的解释。HCV疫苗研究在现有基础上要有新的突破，至少应解决或着重研究以下几个问题：

(1)确定合理的HCV靶抗原。C区基因高度保守，在不同基因型和亚型HCV株之间，大约有95％的氨基酸序列具有同源性，可诱导产生交叉免疫防护作用。HVR1蛋白可诱导高滴度中和抗体，两者结合能否作为较理想的靶抗原[37]?是否需要与HBV包膜基因或Th1样细胞因子基因组合构建嵌合DNA疫苗? 与HBV前S1、前S2或S结合形成的DNA疫苗免疫小鼠可产生高效应的免疫反应，一种疫苗可起到两种防护作用。但使用HBV膜蛋白基因，可能会加重人们一直担心的DNA与宿主基因整合问题；细胞因子水平可调节局部质粒DNA表达蛋白对宿主的免疫原性，增强DNA疫苗效应，但长期表达细胞因子，是否会导致机体免疫耐受?

(2)HCV疫苗是以蛋白类疫苗为主，还是以DNA疫苗为主, 或两者兼而有之?以蛋白类为主的HCV疫苗诱导的中和抗体能持续多长时间?能否对异源性HCV感染起到防护作用?能否诱导CTL反应对慢性HCV感染起到治疗作用?以DNA为主的疫苗，虽然能起到预防和治疗作用，但DNA疫苗的机制以及最令人担心的安全性问题能否得到解决，DNA疫苗在体内长期表达蛋白会对机体免疫系统产生何种影响?

(3)除了黑猩猩外，是否还有其它较理想的临床前试验动物模型?

上述问题应认真研究和解决， Lohmann等[38]成功地在人肝癌细胞进行了HCV RNA的复制试验,这对体外进一步研究HCV生物学特性、抗病毒药物以及病毒疫苗提供了良好的方法，。总之，在HCV DNA疫苗研制方面还有大量的理论和实验工作要做，随着研究的不断探人，我们更应持细心、乐观的态度去研究HCV DNA疫苗的各个环节，以保证其研究工作的有效进展。。