(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110542730 A(43)申请公布日 2019.12.06
(21)申请号 201910811806.1(22)申请日 2019.08.30
(71)申请人 天津云检医学检验所有限公司
地址 300450 天津市滨海高新区滨海科技
产业园高新六路39号9-3-401
申请人 杭州云检医学科技有限公司(72)发明人 凌雪峰
(74)专利代理机构 北京卫智畅科专利代理事务
所(普通合伙) 11557
代理人 陈佳(51)Int.Cl.
G01N 30/02(2006.01)G01N 30/72(2006.01)
权利要求书2页 说明书8页 附图2页
(54)发明名称
一种神经酰胺的绝对定量分析方法(57)摘要
本发明技术方案公开了一种神经酰胺的绝对定量分析方法，将待测样本、工作试剂和溶剂混合均匀后，使其分层形成上层待测样本和下层待测样本，通过高效液相色谱-串联质谱系统检测上层待测样本和定标试剂，从而获得定标试剂的质谱检测结果，根据至少两种定标试剂的质谱检测结果进行定标，根据定标结果和上层待测样本的质谱检测结果，对待测样本中的神经酰胺进行绝对定量分析。本发明技术方案的分析方法采用少量的血清即可有效地对神经酰胺进行分子数的绝对定量。
CN 110542730 ACN 110542730 A
权 利 要 求 书
1/2页
1.一种神经酰胺的绝对定量分析方法， 其特征在于， 包括如下步骤：(1)收集待测样本；
(2)分别配制工作试剂和至少两种成分相同但浓度不同的定标试剂，每种定标试剂中各成分的浓度相同；
(3)按一定比例将所述待测样本、所述工作试剂和溶剂混合均匀后，使其分层形成上层待测样本和下层待测样本；
(4)取部分所述上层待测样本， 并将取得的上层待测样本与所述定标试剂分批进行高效液相色谱-串联质谱系统检测；
(5)根据至少两种定标试剂的质谱检测结果进行定标；(6)根据定标结果和上层待测样本的质谱检测结果，对待测样本中的神经酰胺进行绝对定量分析。
2.如权利要求1所述的神经酰胺的绝对定量分析方法， 其特征在于，所述待测样本为待测血清。
3.如权利要求1所述的神经酰胺的绝对定量分析方法， 其特征在于，每种定标试剂的溶质包括：d16:0神经酰胺、d 18:0神经酰胺、d18:1神经酰胺、d 20:0神经酰胺、d21:0神经酰胺、d 22:0神经酰胺、d23:0神经酰胺、d 24:1神经酰胺和d 24:0神经酰胺中的至少一种；优选地，每种定标试剂的溶剂为脱脂血清。
4.如权利要求1所述的神经酰胺的绝对定量分析方法， 其特征在于，所述工作试剂包括异丙醇和/或甲醇；优选地，所述溶剂为异丙醇。
5.如权利要求1所述的神经酰胺的绝对定量分析方法， 其特征在于，所述将取得的上层待测样本与所述定标试剂分批进行高效液相色谱-串联质谱系统检测， 包括如下步骤：
采用流动相试剂平衡高效液相色谱系统；将色谱柱连接至高效液相色谱系统；
按浓度从低到高依次对定标试剂实施进样；对取得的上层待测样品实施进样。
6.如权利要求5所述的神经酰胺的绝对定量分析方法， 其特征在于，所述流动相试剂包括碳酸氢铵的异丙醇和/或甲醇溶液。
7.如权利要求1所述的神经酰胺的绝对定量分析方法， 其特征在于，所述根据至少两组定标试剂的质谱检测结果进行定标， 包括：
根据所述定标试剂的质谱检测结果， 统计定标试剂中各成分的质谱峰的面积；按照基峰进行归一化处理，获得各成分的离子强度；
将各成分的离子强度与其对应的离子浓度进行线性拟合，获得拟合模型， 完成定标过程。
8.如权利要求1所述的神经酰胺的绝对定量分析方法， 其特征在于，所述根据定标结果和上层待测样本的质谱检测结果，对待测样本中的神经酰胺进行绝对定量分析， 包括：
根据上层待测样本的质谱检测结果， 统计上层待测样本中各成分的质谱峰的面积；按照基峰进行归一化处理，获得各成分的离子强度；分别将各成分的离子强度带入所述拟合模型中，获得相应的分子数量。9.如权利要求1所述的神经酰胺的绝对定量分析方法， 其特征在于，所述串联质谱系
2
CN 110542730 A
权 利 要 求 书
2/2页
统为四极杆串联质谱系统。
10.如权利要求1所述的神经酰胺的绝对定量分析方法，其特征在于，所述串联质谱系统的检测方法为多反应通道检测， 包括母离子扫描、子离子扫描和中性丢失扫描中的至少两种。
3
CN 110542730 A
说 明 书
一种神经酰胺的绝对定量分析方法
1/8页
技术领域
[0001]本发明属于化合物的定量分析领域，具体涉及一种神经酰胺的绝对定量分析方法。
背景技术
[0002]血液由细胞和体液成分组成，细胞成分中包括红细胞、白细胞及血小板，体液为血浆(血清)包含有各种具有特殊功能的蛋白质及数目众多的小分子代谢产物。血液在体内循环往复，与人体各组织相互依存、相互影响，能够反映体内生理病理的代谢变化，通对这些代谢产物的检测与分析，了解之间的细微差别、特征及伴随现象，就能够为我们提供重要的线索或实验依据。氨基酸、酰基肉碱和脂肪酸是血液中重要的代谢产物。神经酰胺是血液代谢中的重要代谢产物。
[0003]由于神经酰胺属于脂类，水溶性不强，因此使用常规的色谱-质谱联用体系，很难做到有效、可靠、高特异性的定量分析。即使通过设计特殊的流动相等方法，使得高效液相色谱能够对神经酰胺进行有效分离和特异性检测，也难以做到神经酰胺分子数绝对定量。[0004]因此，在保证特异性和定量检测的前提下，如何在少量的血清中有效地对神经酰胺进行分子数的绝对定量，是亟待解决的难点问题。发明内容
[0005]本发明技术方案要解决的技术问题是现有的分析方法无法在保证特异性和定量性能的前提下，采用少量的血清即可有效地对神经酰胺进行分子数的绝对定量。[0006]为解决上述技术问题，本发明技术方案提供一种神经酰胺的绝对定量分析方法，包括如下步骤：[0007](1)收集待测样本；[0008](2)分别配制工作试剂和至少两种成分相同但浓度不同的定标试剂，每种定标试剂中各成分的浓度相同；[0009](3)按一定比例将所述待测样本、所述工作试剂和溶剂混合均匀后，使其分层形成上层待测样本和下层待测样本；[0010](4)取部分所述上层待测样本，并将取得的上层待测样本与所述定标试剂分批进行高效液相色谱-串联质谱系统检测；[0011](5)根据至少两种定标试剂的质谱检测结果进行定标；[0012](6)根据定标结果和上层待测样本的质谱检测结果，对待测样本中的神经酰胺进行绝对定量分析。[0013]优选地，所述待测样本为待测血清；所述待测血清可以从血液样本中获得。[0014]优选地，每种定标试剂的溶质包括：d16:0神经酰胺、d 18:0神经酰胺、d18:1神经酰胺、d 20:0神经酰胺、d21:0神经酰胺、d 22:0神经酰胺、d23:0神经酰胺、d 24:1神经酰胺和d 24:0神经酰胺中的至少一种。
4
CN 110542730 A[0015]
说 明 书
2/8页
优选地，每种定标试剂的溶剂为脱脂血清。
[0016]优选地，所述工作试剂包括异丙醇和/或甲醇。[0017]优选地，所述溶剂为异丙醇。[0018]优选地，所述将取得的上层待测样本与所述定标试剂分批进行高效液相色谱-串联质谱系统检测，包括如下步骤：
[0019]采用流动相试剂平衡高效液相色谱系统；[0020]将色谱柱连接至高效液相色谱系统；
[0021]按浓度从低到高依次对定标试剂实施进样；[0022]对取得的上层待测样品实施进样。[0023]优选地，所述流动相试剂包括碳酸氢铵的异丙醇和/或甲醇溶液。[0024]优选地，所述根据至少两组定标试剂的质谱检测结果进行定标，包括：[0025]根据所述定标试剂的质谱检测结果，统计定标试剂中各成分的质谱峰的面积；[0026]按照基峰进行归一化处理，获得各成分的离子强度；
[0027]将各成分的离子强度与其对应的离子浓度进行线性拟合，获得拟合模型，完成定标过程。
[0028]优选地，神经酰胺进行绝对定量分析，包括：[0029]根据上层待测样本的质谱检测结果，统计上层待测样本中各成分的质谱峰的面积；
[0030]按照基峰进行归一化处理，获得各成分的离子强度；[0031]分别将各成分的离子强度带入所述拟合模型中，获得相应的分子数量。[0032]优选地，在所述高效液相色谱中，使用至少一个色谱柱，所述色谱柱包括至少一个反相色谱柱。[0033]优选地，所述串联质谱系统使用电喷雾离子源。[0034]优选地，所述串联质谱系统为四极杆串联质谱系统。[0035]优选地，所述串联质谱系统的检测方法为多反应通道检测，包括母离子扫描、子离子扫描和中性丢失扫描中的至少两种。[0036]优选地，在步骤(3)中，采用离心分离法进行分层，离心力为10000g～12500g，时间为5～10min。
[0037]优选地，所述的混匀方法为移液装置吹打、颠倒混匀、旋转混匀和/或涡旋振荡混匀，优选地为涡旋振荡混匀1～5min。[0038]与现有技术相比，本发明技术方案具有以下有益效果：能够有效地通过以分析物的同位素标记物为内标保证分析的重现性和稳定性，通过串联质谱保证分析的灵敏性和特异性，使用不同组分和浓度的定标试剂，在低样品消耗的条件下实现了血清中神经酰胺的绝对定量。
附图说明
[0039]图1是本发明实施例中神经酰胺(d18:1-16:0)的拟合曲线；[0040]图2是本发明实施例中各神经酰胺的质谱图。
5
CN 110542730 A
说 明 书
3/8页
具体实施方式
[0041]为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述。
[0042]本发明实施例以分析血清中的神经酰胺为例，对本发明技术方案的绝对定量分析方法作以详细说明。当然，除了检测血清，本发明技术方案的检测方法还可以应用于其他需要检测神经酰胺的体液环境中。
[0043]本发明实施例的神经酰胺的绝对定量分析方法，包括以下步骤：[0044](1)收集待测样本：采集血清10μL。[0045](2)分别配制工作试剂和至少两种成分相同但浓度不同的定标试剂，每种定标试剂中各成分的浓度相同。本发明实施例配置了六种不同摩尔浓度的定标试剂(A～F)，在其他实施例可以根据试剂情况决定定标试剂的数量及摩尔浓度。[0046]上述七种试剂的成分和浓度(或体积)如表1-4所示。[0047]表1定标试剂A的成分和浓度
[0048]
[0049][0050]
注：溶剂为异丙醇。
表2定标试剂B的成分和浓度
6
CN 110542730 A
说 明 书
4/8页
[0051]
[0052][0053]
注：溶剂为异丙醇。
表3定标试剂C的成分和浓度
[0054]
[0055][0056]
注：溶剂为异丙醇。
表4定标试剂D的成分和浓度
7
CN 110542730 A
说 明 书
5/8页
[0057]
[0058][0059]
注：溶剂为异丙醇。
表5定标试剂E的成分和浓度
[0060]
[0061]
[0062][0063]
注：溶剂为异丙醇。
表6定标试剂F的成分和浓度
8
CN 110542730 A
说 明 书
6/8页
[0064]
[0065][0066]
注：溶剂为异丙醇。
表7.工作试剂的成分和体积
[0067]
(3)按一定比例将所述待测样本、所述工作试剂和溶剂混合均匀后，形成上层液体
与下层沉淀；其中神经酰胺位于上层待测样本中。[0069]具体地，溶剂为异丙醇，待测样本、工作试剂及异丙醇按表8的体积混合，并涡旋振荡1min以充分混匀。
[0070]表8.上层待测样本及各类试剂的体积
[0068]
[0071]
[0072]
将混和均匀后的样品在12000g的离心力下，离心10min，离心后样品分为上层液体
与下层沉淀。[0073](4)取部分所述上层待测样本，并将取得的上层待测样本与所述定标试剂分批进行高效液相色谱-串联质谱系统检测。[0074]首先，使用流动相试剂，以3.00mL/min的流速平衡Vanquish高效液相色谱5min，流动相试剂为碳酸氢铵的异丙醇和甲醇溶液，本发明实施例的流动相试剂的具体成分和浓度如表9所示。
[0075]表9流动相试剂的成分和浓度
9
CN 110542730 A
说 明 书
7/8页
[0076]
[0077]
然后将ACE SuperC18色谱柱(2.1mm×100mm×1.7μm)连接到高效液相色谱，保持
恒温30℃后开始分批次进样。
[0078]按浓度从低到高依次对六种定标试剂实施进样；[0079]随后，对取得的上层待测样品实施进样；[0080]最后，高效液相色谱-串联质谱系统检测定标试剂和上层待测样品。[0081]上述高效液相色谱流动相及分离条件如表10所示。[0082]表10高效液相色谱流动相及分离条件
[0083]
随后经过由三个四级杆质谱仪串联而成的串联质谱仪，进行多反应检测扫描模
式，其中质谱的检测条件如下：[0085]电离方式：电喷雾电离，ESI(+)；[0086]离子喷雾电压：3.5kV；[0087]鞘气(Arb)：35；[0088]辅助器(Arb)：15；[0089]吹扫气(Arb)：0；
[0090]离子传输毛细管温度(℃)：300；[0091]喷雾器温度(℃)：275；[0092]检测方式：选择反应监测(SRM)；[0093]循环时间(sec)：0.8；[0094]Q1分辨率(FWHM)：0.7；[0095]Q3分辨率(FWHM)：0.7；[0096]碰撞气(mTorr)：1.5；[0097]源内裂解电压(v)：0；
[0098]通过检测获得扫描后的定标试剂和上层待测样本的碎片离子丰度。[0099](5)根据定标试剂的质谱检测结果进行定标。[0100]首先，根据所述定标试剂的碎片离子丰度图，统计定标试剂中各成分(16:0神经酰胺、18:0神经酰胺、20:0神经酰胺、22:0神经酰胺、24:1神经酰胺、24:0神经酰胺)的质谱峰的面积；
10
[0084]
CN 110542730 A[0101]
说 明 书
8/8页
并按照基峰进行归一化处理，分别获得16:0神经酰胺、18:0神经酰胺、20:0神经酰
胺、22:0神经酰胺、24:1神经酰胺、24:0神经酰胺在不同浓度时的离子强度；[0102]最后，将16:0神经酰胺、18:0神经酰胺、20:0神经酰胺、22:0神经酰胺、24:1神经酰胺、24:0神经酰胺的离子强度与其对应的离子浓度进行线性拟合。由于本发明实施例的神经酰胺属于一类物质，因此检测出的神经酰胺的种类很多，但是其线性拟合的方法是一样的，在此不一一列举。图1示出了神经酰胺(d18:1-16:0)拟合后的线性模型，横轴为浓度，纵轴为化合物峰面积与内标峰面积的比值，拟合参数为：k＝8.698e-3，b＝13.797e-3，拟合系数为0.9907。[0103](6)根据定标结果和上层待测样本的质谱检测结果，对待测样本中的神经酰胺进行绝对定量分析。
[0104]上层待测样本中各神经酰胺的质谱图如图2所示，横坐标为时间，纵坐标为相对丰度，右上角的数据表示不同成分通道中的离子信号强度。从上到下依次为：d16:0神经酰胺、d18:0神经酰胺、d20:0神经酰胺、d24:1神经酰胺、d24:0神经酰胺、d22:0神经酰胺。分别将各离子强度带入拟合模型，即可计算出各不同碳链长度的神经酰胺在血清中的分析数量。[0105]本发明虽然已以较佳实施方式公开如上，但其并不是用来限定本发明，任何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施方式所作的任何简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。
11
CN 110542730 A
说 明 书 附 图
1/2页
图1
12
CN 110542730 A
说 明 书 附 图
2/2页
图2
13
因篇幅问题不能全部显示，请点此查看更多更全内容